喉癌中S100A8基因调控机制研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 喉癌中SIOOA8基因调控机制研究 -jJ-·_■一 刖 吾 喉癌是头颈部常见肿瘤之一，其发病率有逐年上升的趋势，越来越多资料支 持炎症是肿瘤形成及进展的重要病因之一，我们的临床资料同样显示喉癌患者通 常具有慢性炎症病史。在前期工作中，我室充分利用东北地区的病源优势，应用 blot、免疫组织化 比较基因组杂交(CGH)和cDNA芯片结合RT-PCR、Western 学染色等实验技术证明炎症因子$100A8在转录和翻译水平上的表达存在显著地 差异性，提示可能存在甜D伽占基因转录后调节的异常。micmRNA是近年来发现 的一类大小为18,23m的小非编码转录后调节因子，由具有发夹结构、长约70～ 胞质中与Argonaute等蛋白分子形成miRISC(miRNAinducedsilencingcomplex)。 在miRNA的指引下，miRISC可以特异性地识别mRNA分子的37端长约30个 碱基的非编码区，并以完全或不完全匹配的方式与其结合，降解靶基因mRNA或 抑制其翻译。由于存在这样不同类型的匹配方式，使得一种mLRNA可以与多种 mRNA分子结合。生物信息学等研究结果表明，人类有1／3以上的蛋白编码基因 受miRNA调节。miRNA通过调节目的基因的蛋白表达，发挥着类似癌基因或肿 瘤抑制基因的功能，如在生物体发育、信号转导、凋亡、细胞增殖等过程中起重 要作用。另外，蛋白质相互作用在生命活动中扮演着关键角色，参与了生物学中 的许多生理病理活动的调控，如复制、转录、翻译、剪切、分泌、细胞周期调控、 信号转导和细胞代谢等，也是寻找下游靶基因的重要手段之一。我们前期通过 B信号通路参与喉癌的发生和发展， RNA干扰实验等发现S100A8通过NF．Kappa B信号 通路的具体机制研究均未见报道。在本研究中，我们通过生物信息学资源结合荧 过喉癌中S100A8相互作用蛋白的研究，深入探讨$100A8基因在喉癌中的上下游 调控机制，一方面可为阐明$100A8基因在喉癌发生和发展过程中的分子机制创造 条件并提供新的线索，另一方面为开展以microRNA为靶点或通过蛋白相互作用 设计竞争性抑制剂的喉癌诊断和治疗奠定基础。 材料与方法 利用生物信息学软件对$100A8基因37非翻译区进行microRNA靶向预测， 喉癌组织中的表达情况。构建野生型及突变型SIOOA8基因荧光报告素酶表达载 blot检测分析靶向microRNA 体，转染Hep2细胞，通过荧光定量PCR及Western 察并检测共转染靶向microRNA及荧光报告素酶质粒前后喉癌细胞形态学和细胞 体外侵袭能力的变化，综合分析靶向mieroRNA对Hep2生物学行为的影响。以喉 癌Hep2细胞系为实验材料，应用免疫沉淀结合质谱技术筛查S100A8相互作用蛋 白质并通过免疫共沉淀及细胞免疫荧光化学对相互作用蛋白质进行验证，通过 RNA干扰技术进一步揭示相互作用蛋白质之间的调控关系。 实验结果 一、肼OOA8 mRNA靶microRNA预测 采用MiRanda和RNA22软件，我们在$100A8 mRNA第341bp碱基位置(3 非翻译区)预测到一个miR-24结合位点，其与大鼠的同源性高达95％。 二、喉癌中miR-24表达 的表达下调，双侧f检验分析具有统计学意义(尸0．05)。 三、miR-24对$100A8基因靶向调节 测序结果表明，我们成功地构建了$100A83’Un四生型和突变型荧光报告 2 miR-24前体组的报告基因活性相对于其它对照组明显降低，具有统计学意义(尸 O．05)，而anti．miR-24fl邑明显