长春新碱诱导肝癌细胞自噬性凋亡过程中泛素与bcl2的变化.DOCVIP

临床医学论文-长春新碱诱导肝癌细胞自噬性凋亡过程中泛素与bcl2的变化 【摘要】? 目的 探讨长春新碱(VCR)诱导HepG2肝癌细胞自噬性凋亡过程中泛素表达的变化及阻断泛素蛋白酶体通路对此凋亡和bcl2表达的影响。方法 应用VCR诱导HepG2细胞自噬性凋亡，采用流式细胞仪检测凋亡及泛素的表达；以RTPCR检测bcl2的表达。结果 VCR处理后发生自噬性凋亡的HepG2细胞中泛素含量增加（P0.01）。加用蛋白酶体特异抑制剂乳胞素后的乳胞素+VCR组凋亡率明显比单用VCR组高（P0.01），而bcl2表达则比单用VCR组更低。结论 泛素蛋白酶体通路参与了VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡及对bcl2蛋白的调控。对蛋白酶体功能的抑制可以促进VCR诱导的HepG2细胞凋亡。 【关键词】? 长春新碱；泛素蛋白酶体通路；肝癌细胞；凋亡；bcl2 ??? Key words：Vincristine;Ubiquitinproteasome pathway;Hepatoma cell;Apoptosis; bcl2 ??? 新近的研究显示泛素蛋白酶体通路（ubiquitinproteasome pathway，简称泛素通路）是细胞凋亡调控的主要机制之一，这种机制可能是肿瘤等疾病治疗的一个独特靶点，有关研究认为泛素通路参与凋亡的调控是通过对bcl2蛋白的调节而发挥作用的[1]。长春新碱（vincristine,VCR）是一种常用的抗癌药物。本研究中，作者先用VCR诱导了人肝癌细胞系HepG2细胞自噬性凋亡，在此凋亡模型[2]基础上，特定研究了VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡过程中泛素通路及bcl2表达的有关变化。 ??? 1? 材料与方法 ??? 1.1? 细胞及培养 ??? 人肝癌细胞系HepG2细胞（购自上海中科院细胞所）用含10%小牛血清的RPMI1640培养液(Gibco BRL公司)培养。 ??? 1.2? 细胞分组与加药处理 ??? 未加药对照组仅加等体积生理盐水。VCR处理组的药物处理基本同文献[2]（VCR为sigma公司产品），即于培养液中加入1μg/mL的VCR去诱导。在药物作用不同时间后用0.125%胰蛋白酶EDTA消化收获细胞行以下实验。 ??? 1.3? 泛素的定量检测 ??? 分别将对照组、VCR作用4h组、VCR作用16h组的HepG2细胞经固定、漂洗后加1∶200的抗泛素(博士德公司)，4℃过夜，加1∶64的IgGFITC(Sigma产品)于室温作用30分钟后用Elite流式细胞仪(COULTER公司)分别检测各组平均荧光强度。 ??? 1.4? bcl2表达的RTPCR检测 ??? 1.4.1? 被检测细胞分三组：对照组、VCR 16h组、乳胞素+VCR 16h组。乳胞素(Lactacystin，CALBIOCHEM公司)为蛋白酶体的抑制剂，使用浓度为10μM[3]，细胞加用乳胞素8h后再加用VCR处理16h。 ??? 1.4.2? 用Goldkey软件设计bcl2引物，由上海生物工程公司分别合成，bcl2扩增引物为sense: 5′GGACAACATCGCCCTGTG3′(551～568); antisense: 5′AGTCTTCAGAGAACAGCCAGGA3′(668～688), 扩增片段为137bp；内参照GAPDH扩增引物为sense: 5′GGTGAAGGTCGGTGTCAACG 3′；antisense: 5′caaagttgtcatgcatgacc 3′，扩增片段为496 bp。 ??? 1.4.3? RNA分离用Trizol reagent总RNA分离试剂盒(Gibco公司)从细胞中提取细胞RNA。 ??? 1.4.4? cDNA合成用THERMOSCRIPT RTPCR System试剂盒（Gibco公司）将分离的RNA逆转录成cDNA。 ??? 1.4.5? PCR以此cDNA为模板行扩增反应。RTPCR反应体系：模板20μL,上游引物（10μmol/L）和下游引物(10μmol/L)各2μL，dNTP4μL(10mmol/L)，10×Taq多聚酶缓冲液10μL，TaqDNA聚合酶1μL(5u)。PCR循环参数为94℃，1.5min；52℃，1.5min；72℃，2.5min;44个循环后72℃，20min。 ??? 1.4.6? 取PCR产物行电泳分析(电泳仪、电泳槽为BioRad公司产品)。以X174Hinc II digest DNA Marker(TaKaRa Biotech)为分子量参照。 ??? 1.5? 细胞凋亡率的FCM检测 ??? 分别检测对照组、VCR 4h组、VCR 16h组、乳胞素+VCR 16h组