人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建.docVIP

人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建 作者：韩者艺，何凤田，陈宝军，乔泰东，王海燕，韩英，郑建勇，吴开春，樊代明 【关键词】 胃肿瘤 　　关键词: 胃肿瘤;人抗体，肿瘤;噬菌体 　　摘 要:目的 利用噬菌体表面展示技术，构建人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库. 方法 从胃癌手术患者胃一级站淋巴结中提取总RNA，反转录成cDNA后，用PCR扩增人IgG1Fd段及κ轻链，并克隆至噬菌粒载体pCOMB3中，转化宿主菌株XL1-Blue，以辅助噬菌体M13K07超感染噬菌粒文库，构建成人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库. 结果 得到一个含克隆数为1.2×106 ，实际滴度约为2.56×1015 pfu#12539;L-1 的IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库. 结论 IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库的成功构建，为下一步利用亲和富集筛选技术，获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础. 　　Keywords:stomach neoplasms;antibodies，neoplasms;bac-teriophages 　　Abstract:AIM To construct a phage display library of hu-man IgG1Fab antibodies from lymph nodes of gastric cancer patients using phage display technique.METHODS Total RNA was isolated from lymph nodes of gastric cancer pa-tients.Fd fragment and kappa light-chain were amplified by RT-PCR and cloned into the phagemid pCOMB3and ex-pressed as a fusion protein with phage M13PⅢin E.coli XL1-Blue.In the presence of help phage M13K07，the Fab fusion protein was displayed on the surface of recombinant phage.RESULTS We have constructed a phage display li-brary of human IgG1Fab antibodies whose titer was about2.56×1015 pfu#12539;L-1 .CONCLUSION This library could be used to prepare human IgG1Fab antibody. 　　0 引言 　　单克隆抗体的出现使肿瘤抗体介导的免疫治疗发生了突破性进展.然而，目前所用的抗体多为动物源性抗体，用于人体会产生异源性抗体反应，影响效果，限制了免疫治疗的发展.使用人源性抗体则可避免异源性抗体反应.但是，用传统方法制备人源性抗体十分困难，1990年代初建立的噬菌体表面展示抗体库技术为制备人源性抗体开辟了一条快捷途径，促进了人源性抗体的发展.我们利用噬菌体表面展示抗体库技术，从胃癌手术患者一级站淋巴结中提取总RNA，构建了胃癌人源性抗体IgG1Fab段的噬菌体表面展示文库，为下一步利用亲和富集筛选技术，获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　淋巴结标本采自西京医院胃肠外科，经病理诊断为胃癌病例的一级站引流淋巴结.宿主菌株E.coli XL1-blue由本室保存，含有F’因子，携带四环素抗性基因（Tetr ）.噬菌粒载体pCOMB3含有氨苄青霉素抗性基因（Ampr ），LacZ启动子及噬菌体间隔片段和用于克隆Fd段的SpeI，XhoI克隆位点及用于克隆轻链的XbaI，SacI克隆位点.辅助噬菌体M13K07，为Phamasia公司产品，带有突变型基因Ⅱ，复制起始位点和卡那霉素抗性基因（Kanr ）.RNA提取试剂、限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、DNA纯化试剂盒分别为Promega公司、华美生物制品公司产品，cDNA反转录试剂盒为MBI公司产品.TaqDNA聚合酶和dNTPs为Promega公司产品.引物由上海生工生物制品公司合成，序列参照文献［1］ 设计，引物浓度为50pmol#12539;L-1 .其中P1，P2为Fd段5’端引物