三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响.docVIP

三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响 【摘要】 观察三七总皂苷（PNS）对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖和体外诱导其分化为心肌样细胞的作用。【方法】 采用骨髓细胞体外培养技术分离大鼠MSCs，以流式细胞仪检测细胞表面标志；采用四甲基偶氨唑盐（MTT）法观察PNS对MSCs的增殖影响；采用第8代MSCs进行体外心肌细胞诱导分化；采用相差显微镜、免疫组化及逆转录 含酶链反应（RTPCR）鉴定心肌细胞。【结果】 大鼠MSCs细胞表面抗原CD44阳性，CD34阴性；经PNS作用后MSCs增长速度比空白对照组明显加快，体外诱导后细胞形态发生变化，其细胞免疫组化呈结蛋白（Desmin）、肌钙蛋白(cTnI)阳性；RTPCR显示诱导后细胞转录肌球蛋白重链mRNA水平增加。【结论】 PNS能促进大鼠MSCs体外增殖并可诱导MSCs分化为心肌样细胞，为细胞移植治疗心肌梗死提供了实验依据。 【关键词】 三七总皂苷/药现象 骨髓间充质干细胞/病现象 心肌梗死/中药疗法 细胞培养 心肌梗死后，如何促进心肌细胞的再生是心血管病学家面临的一个难题。人们一直试图寻找一种细胞移植材料以修复坏死心肌、改善心脏功能。近年来，干细胞的研究为人们提供了新的希望。骨髓间质干细胞（mesemchymal stem cells, MSCs）是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞，具有向成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等分化的能力［1］，并且在体外易于分离培养和扩增，这些特性使MSCs成为在细胞治疗中有效发挥作用的理想细胞。目前国内外多用5氮胞苷（5azacytidine，5aza）来诱导MSCs分化为心肌细胞，我们通过广泛筛选，发现三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponins，PNS）可作为MSCs分化为心肌细胞的诱导剂，为心肌损伤的干细胞移植治疗提供一种理想的细胞材料。现报道如下。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 纯种7周龄 SD大鼠，SPF级，雌雄不限，体质量190g，由广州中医药大学动物实验中心提供，合格证号：0004979。 1.1.2 主要试剂与仪器 IMDM（Iscoves modified Dulberccos medium）培养基购于Gibco公司；特级胎牛血清(FBS)购于Hyclone公司；5氮胞苷购于Sigma公司；PNS（批号：0870-200303）购于广州市药检所（纯度99％）；Percoll梯度分离液购于Pharmacia 公司；荧光标记抗大鼠抗体CD34FITC、 CD44FITC和小鼠抗人结蛋白抗体（Desmin）单抗、小鼠抗人肌钙蛋白I（cTnI）单抗购于Santa Cruz公司；链霉亲含素-生物素复合物（SABC）试剂盒及二氨基联苯胺（DAB）显色剂购于武汉博士德公司；Trizol为Gibco公司产品；聚合酶链反应（PCR）引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成；Access RTPCR试剂盒为Promega公司产品；倒置显微镜（日本，OLYMPUS）；CO2培养箱（美国力高公司）；流式细胞仪（美国BECKMAN COULTER）；PCR基因扩增仪（美国PE9600）。 1.2 方法 1.2.1 MSCs的分离与培养 参照Wakitani ［2］的方法并作改进：将SD大鼠用水合氯醛腹腔麻醉，体积分数75％酒精浸泡5min，分离出股骨、胫骨；用含有肝素的IMDM培养液冲出骨髓，用吸管吹打制成细胞悬液，并移入离心管中，1000r/min离心10min； 弃上清及脂肪层，收集沉淀物用完全培养基（含IMDM、体积分数为10％FBS、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素）充分混匀，加入含1.073g/mL的Percoll分离液的离心管内，1500r/min离心20min；重复上一操作，收集中间云雾状的单核细胞层，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，用完全培养基接种于25mL培养瓶中，并标记为P1，置37℃含体积分数5%CO2的孵箱中进行原代培养。在培养的第4天进行首次换液。在相差显微镜下观察细胞生长情况。 1.2.2 MSCs的传代及纯化 参照Pittenger［3］的方法并加以改进：待原代培养的细胞增殖近整个培养瓶的底面时，用胰酶消化细胞后，用培养液中止消化并反复吹打贴壁细胞，制成单细胞悬液，按1：3传代培养，并标记为P2，以后每天观察细胞的生长情况，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传至第8代。 1.2.3 MSCs的鉴定 取第3代MSCs，胰酶消化后，加入荧光标记的抗CD34、CD44抗体，4℃孵育30min