复方鳖甲软肝方防治肺纤维化大鼠自由基损伤作用的实验研究.docVIP

由基产生的影响  　  　 材料与方法　 １．　实验材料　 １．１　实验药物　 复方鳖甲软肝方原料粉 以下简称复方药 即复方鳖甲软肝片原料粉 由内蒙古福瑞制药有限公 司提供 批号醋酸强的松 在本实验中为阳性对照药 广东华南制药厂生产 批号 ０１１２０１ 注射用盐酸博莱霉素 日本化药株式会社制造 批号 Ｘ１２１００ 　 １．２　实验动物　 ＳＤ 大鼠 雄性 体重 ２０６ 土 １６ｇ 实验动物和饲料购自北京维通利华实验动物技术有限公司 实 验动物饲养在洁净级动物房 适应性喂养一周 饲料为该公司提供的固体全价饲料 饮用水为自来水 实验期间自由饮水和进食 １．３　实验主要试剂　 １．３．２　主要化学试剂　 　 叠氮化钠（ＮａＮ３） 乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ－Ｎａ２） 乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ） 十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）， 均为 Ｓｉｇｍａ 公司产品 ５，５ －二硫邻硝基苯甲酸（ＤＴＮＢ） 四乙氧基丙烷，Ｆｌｕｋａ　公司产品 硫代巴比妥 酸（ＴＢＡ） 上海化学试剂二厂 ＳＯＤ 试剂盒和诱导型一氧化氮合酶 ｉＮＯＳ 试剂盒购自南京建成生物工 程公司 　 丙烯酰胺 双丙烯酰胺 Ｔｒｉｓ，过硫酸铵 以上试剂均为 Ｂｉｏ－ｒａｄ 公司产品 分析纯或优级纯 ＤＴＴ 二硫苏糖醇 溴酚蓝 Ｔｗｅｅｎ　２０ 以上试剂为 ｓｉｇｍａ 公司产品 ＮＦ－ Ｂｐ６５（Rabbit polyclonal IgG ｓｃ－３７２），Ｉ Ｂ 　（Rabbit polyclonal　ＩｇＧ ｓｃ－８４７） 均为 Santa Cruz 公司产品 Alkaline phosphates goat anti-rabbit IgG NBT/BCIP 显色浓缩液 １．３．５　主要实验仪器　 购自北京中山生物技术有限公司 　 ７５０４ 型紫外可见分光光度计 低温高速离心机 垂直板电泳仪 电印迹装置 　 ２．　实验方法　 ２．１　实验动物造模方法　 参考张东伟等 ５ 改进的方法进行 　 ２．１　实验动物分组和给药方法　 ＳＤ 大鼠分为正常组 假手术组 模型组 强的松组 复方药高剂量组 复方药中剂量组 复方药 低剂量组等 ７ 组 每组 １０ 只 大鼠造模后的第 ２ 天 各组大鼠分别给服生理盐水 醋酸强的松 复方 鳖甲片原料粉 复方鳖甲软肝方原料粉和醋酸强的松片 使用时分别用蒸馏水溶解 配成不同浓度混 悬液备用 其中正常组 假手术组 模型组大鼠分别给予 ０．９％生理盐水 给药剂量为 ０．０１４Ｌ／ｋｇ 强 的松组大鼠给予醋酸强的松混悬液 给药剂量为 ０．５６ｍｇ／ｋｇ 复方药高剂量组 复方药中剂量组 复 方药低剂量组大鼠分别给予高剂量 １．４ｇ／ｋｇ 中剂量 ０．７ｇ／ｋｇ 低剂量 ０．３５ｇ／ｋｇ 复方鳖甲软 肝方原料粉混悬液 清洗后 置于－６０ 各组大鼠每天灌胃容积相等 冻存备用 　 每周连续给药 ６ 天 连续给药 ４ 周 取肺脏冷 ＰＢＳ ２．２　肺组织匀浆制备方法　 取出所需肺组织 放入冷生理盐水中漂洗除去浮血 滤纸吸干后 在冰浴上剪成碎块 称取适量 组织 加入 １０ 倍量预冷的 ０．２Ｍ 磷酸缓冲液 以冰浴中快速研磨制成 １０％组织匀浆 ５０００ｇ 离心 １５ｍｉｎ 取上清液进行测定  　 ２．３　各生化指标测定方法　 ＭＤＡ 与硫代巴比妥酸 ＴＢＡ 在酸性条件下共热 形成粉红色复合物 该物质在波长 ５３２ｎｍ 有最大 吸收峰 ＧＳＨ 和 ５，５ －二硫对硝基苯甲酸 ＤＴＮＢ 反应在 ＧＳＨ－Ｐｘ 催化下可生成黄色的 ５－硫代 ２－硝基 苯甲酸阴离子 该物质在波长 ４２３ｎｍ 波长有最大吸收峰 Ｏ２． 氧化羟胺的最终产物为亚硝酸盐 后者 在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色 该物质在波长 ５３０ｎｍ 处有最大吸收峰 ＮＯＳ　催化 Ｌ－精氨 酸和分子氧反应生成 ＮＯ ＮＯ 与亲核性物质生成有色化合物 该物质在波长 ５３０ｎｍ 下有最大吸收峰 　 ２．４　肺组织胞浆蛋白和核蛋白的制备方法　 取 １００ｍｇ 肺组织，冻于液氮中 隔铝泊纸捣碎 用 １ｍｌ 缓冲液 0.6%NP-40 150mmol/L NaCl 10 mmol/L 和 HEPES(pH7.9) 1mmol/LPMSF 溶解粉末，乳钵匀浆 将匀浆液转入 １．５ｍｌ 管中离 心，０ ，２０００ｇ，３０ ，弃未破碎组织 上清液在冰中静置 １５ｍｉｎ，离心，０ ，５０００　ｇ １５ｍｉｎ 小心移取上 清液 分装，－２０ 保存 即为胞浆蛋白 将下层