聚乙二醇修饰对去折叠胰蛋白酶的影响.pdfVIP

摘要 摘要 天然胰蛋白酶(NT)容易受外界因素的影响，热稳定性不好，自溶严重。 前期研究表明动态高压微射流(DHPM)诱导的去折叠胰蛋白酶(DT)热稳定 性提高，但去折叠胰蛋白酶的结构处于热力学上的不稳定状态，容易集聚或再 折叠而影响其酶学性能。本课题旨在研究琥珀酰亚胺碳酸酯和琥珀酰亚胺琥珀 去折叠胰蛋白酶活性、热稳定性、自溶、动力学参数和构象变化的影响，对比 分析了天然胰蛋白酶和去折叠胰蛋白酶的修饰效果。 然胰蛋白酶的活性影响不大，但是酶热稳定性提高，酶自溶降低，其中mPEG．SC 未修饰的42．3％提高到73．9％。构象变化分析表明，紫外吸光值和荧光强度都下 降了，并伴有轻微的蓝移，圆二色谱中负椭圆度升高，说明mPEG．SC修饰影响 了天然胰蛋白酶的构象，发色基团部分被掩埋，疏水环境部分被屏蔽，酶分子 的微环境发生了变化，二级结构的∥．折叠含量上升，无规则卷曲含量下降。 5000Da的mPEG．SC修饰后天胰蛋白酶的构象变化最明显，如修饰后天然胰蛋 白酶的B．折叠含量由51．2％提高到56．7％。 mPEG．SC修饰对去折叠胰蛋白酶的活性影响不大，但去折叠胰蛋白酶热稳定性 得到了极大的提高，酶自溶极大降低了。同时，修饰的去折叠胰蛋白酶与底物 的亲和度及催化效能明显提高。修饰后去折叠胰蛋白酶的Km值从0．35mM下降 后去折叠胰蛋白酶的紫外吸光值和荧光强度都下降了，荧光吸收峰有明显的蓝 移，说明酶分子中的发色基团和疏水环境被部分掩埋，酶分子所处的微环境发 生了改变。二级结构的伊折叠含量上升，无规则卷曲含量下降，修饰后去折叠 胰蛋白酶和去折叠胰蛋白酶的影响，表明修饰的去折叠胰蛋白酶的酶学性能得 摘要 到了更大程度的改善，而其空间构象的变化也更大。另外，结果表明修饰酶的 酶学性质变化与构象改变之间有一定的关联性。 化的影响，表明修饰后去折叠胰蛋白酶明显提高了对尿素变性作用的抗性。随 着尿素浓度的升高，酶样的构象逐渐被破坏，天然胰蛋白酶的结构在尿素浓度 为6mol／L时受到最大程度的破坏，去折叠胰蛋白酶在4mol／L时就遭受严重破坏， 而修饰后去折叠胰蛋白酶在8mol／L时才遭受严重破坏。 的影响，表明修饰后的酶活变化不大，但是相比于天然胰蛋白酶，修饰后去折 叠胰蛋白酶的热稳定性及与底物的亲和度都大幅提高，自溶大幅降低。另外， 对比mPEG．SS和mPEG．SC对天然胰蛋白酶或去折叠胰蛋白酶的修饰效果，表 明mPEG．SC的修饰效果更好。 关键词：去折叠胰蛋白酶；化学修饰；聚L--醇；活性；热稳定性；构象 II ABSn认CT ABSTRACT Native tovariouskindsfactorinenvironment trypsinfNT)islikelysubjected whichcauseadecreaseofthermal andanincreaseof stability researchindicatedthattheunfolded trypsin(DT)inducedbydynamichigh-pressure hadenhancedthermal microfluidization(DHPM)treatment unfoldedisinatransitional unfavorable state，it protein thermodynamically generally refoldsor withothermolecules．Thiswasto aggregatesbyinteracting subject study theeffectof