沙眼衣原体热休克蛋白60原核表达载体的构建、表达和蛋白纯化.pdfVIP

沙眼衣原体热休克蛋白60原核表达载体的构建、表达和蛋I。j纯化 沙眼衣原体热休克蛋白60原核表达载体的构建、表达和蛋白纯化 专业：皮肤病与性病学 硕士牛：刘隽华 指导教师：韩建德丰任医师 摘 要 背景与目的 沙眼衣原体(Chlamydia 之一。衣原体生殖道感染发病率逐年增加，女性若发生C．t的反复、慢性感染， 可导致输卵管粘连、狭窄甚者闭锁，继而引发异位妊娠(EP)和输卵管不育(TFI) 等，其具体机制尚不清楚。多数研究者认为免疫反应在慢性损伤后遗症的发牛中 起很大作用，其中沙眼衣原体热休克蛋白60(cHsp60)在免疫致病中起关键作 用。 cHsp60是衣原体髓外膜的主要成分，基本功能是参与细胞结构的维持、修 复和免疫，与人的相应Hsp60有48％的同源性。到目前为止，已有多项报告说明 cHsp60与人类衣原体性疾病的免疫致病机制相关，推测cHsp60可能是人类衣原 体疾病免疫致病的重要因素，是刺激机体产牛免疫反应的重要表面抗原。对 cHsp60保守抗原决定簇的自身免疫应答可能是引起人体局部免疫反应，导致女 性输卵管损伤的关键因素。 国外研究表明，持续、长期的cHsp60抗体反应与输卵管中C．t的存在有关， 而且Ct感染持续存在时间越长，cHsp60抗体反应越强，疾病越严重。目前对 cHsp60的研究主要集中在抗原成分的识别及免疫致病机制方面，尚未有合适的 能反映cHsp60抗体反应的免疫病理过程的动物模型，致病机制尚不清楚。目前 国内的相关研究仅限于cHsp60抗原的表达及血清学检测的水平，动物模型和组 织免疫病理学研究仍处于待开发状态。 纯化出可溶形式的目的蛋白。为下一步动物实验研究慢性上牛殖道炎症模式下主 沙眼衣原体热休克蛋白60原核表达载体的构建、表达和蛋F1纯化 要与cHsp60抗原有关的血清学的改变、免疫病理学变化及证实cHsp60是否为疾 病发牛过程中的关键因素提供cHsp60抗原。 材料与方法 1．构建重组表达载体 依据cHsp60基因序列，设计一对特异性引物，PCR法扩增目的基因。双酶切 扩增片段和表达载体，酶切产物连接，连接产物转化入克隆菌株，筛选阳性克隆， 抽提质粒，PCR、双酶切和测序鉴定。 2．目的蛋白的表达与纯化 将单个转化菌扩大培养，以最佳条件诱导表达，收集菌体，超声波裂解，收 测纯化效果。标定最终体积、浓度，保存目的蛋白备用。 结果 1．重组表达载体的鉴定 应用PCR的方法，成功扩增出大量的目的基因片段，电泳检测结果与理论预 测值相符。重组质粒PCR和双酶切鉴定结果也与理论值一致，表明目的基因已成 功插入表达载体中。重组体DNA测序显示与Genebank一致。 2．目标蛋白的鉴定 明目的蛋白已有效分离，并具有抗原性。 结论 达融合蛋白是可行的，可以诱导产生可溶的活性蛋白。 2．利用}{is—tag融合标签可以高效、快速地纯化目的蛋白。 3．木实验证明：利用原核表达系统，构建cHsp60基因重组体，表达目的蛋白的 设想是可行的，可以获得可溶形式的蛋白。 关键词：沙眼衣原体，Hsp60，亲和层析 沙眼衣原体热休克蛋白60原核表达载体的构建、表达和蛋白纯化 Construct andPurificationof ion， Expression Chlamydia trachomatisHSP60 Major：Dermatology Liu Postgraduate：Juanhua Tutor：Prof．Hanande Ji Abstract and BackgroundPurpose C． trachomatisisnow asoneofthemostcommon