SARS冠状病毒S蛋白抗原表位多肽设计、合成及其免疫反应.pdfVIP

第一军医大学博士论文 摘要 结构蛋白，S蛋白是冠状病毒表面最大的结构蛋白，在病毒与宿主细胞 表面受体结合及介导膜融合并进入细胞的过程中起关键性作用。既往对 冠状病毒s蛋白的研究表明，s蛋白是SARS．CoV与宿主细胞膜受体的 结合部位，包含重要的中和抗原表位，是进行抗SARS疫苗设计的重要 位点。s蛋白突变率较低的冠状病毒，通过s蛋白己经获得了有效的疫 菌。SARS—CoV的S蛋白的氨基酸突变率不高，通过S蛋白很有希望获 得有效抗的SARS疫苗。 目的：本实验将根据SARS．CoVS蛋白的序列，通过网络共享软件 对s蛋白的二级结构、理化性质和s蛋白的抗原表位进行生物信息学预 测与分析，并根据预测结果设计并合成出一系列的候选抗原表位多肽进 行免疫学研究。通过将合成的抗原表位多肽与SARS康复病人的血清反 应，以及在动物体内的免疫反应，以发现s蛋白的抗原表位，从而为基 于s蛋白的亚单位疫苗深入研究打下基础。 and 方法：利用Expasy提供的网络共享工具软件Proteomics tools对s蛋白的二级结构预测，信号肽切割位点，穿 sequenceanalysis 膜螺旋，N．糖基化位点，0．磷酸化位点， 半光氨酸结合状态，亲水性， PREDICTINGANTIGENICPEPTIDES软件对B细胞抗原表位进行预测。利 MHC—I和MHC．II限制性的T细胞抗原表位预测。根据B细胞抗原表 位预测结果设计并合成抗原表位多肽。抗原表位多肽采用Fmoc-butyl固 相合成侧链保护策略，在多肽合成仪上进行合成，HPLC进行纯化，电 ionization SOI／rCC，ESI)进行结构鉴定。抗原表 喷雾电离法(electrospray 第一军基大学德士论文 位多月太采用间接ELISA法测定SARS相关冠状病毒抗原表位肽与SARS 病人』靓清中抗体的反应。根据抗体反应呈阳憾的抗原表位多肷，综合S 蛋白的：二级结构和理化性质及T细胞抗原表位鲍预测与分橱结粜，设计 著禽袋灏匏藐覆多获。缘会设计懿撬覆多簸采爝皮下注麓豹方式对凝蟊 兰家兔进行免疫。角间接ELISA法检测免疫蒙兔产生抗体的滴度。 结果：预测结果表明，在s蛋白中存在一个球状结构区域(s1区) 和三个螺旋区(s2区)，螺旋结构分别位于残潦729—769，880一1015， 1163一lt84。S蛋白静信号骚甥害l位点位于K一漩弱13像氨基酸残蘩(Gly) 和i4位氨基酸(Set)蔑鏊之间。S蛋自在Ii96—1218之滴存在…蔽穿膜 螺旋结构，1—1195段处于胞膜外，1219—1255则在胞膜内。S鬣白共 有23个糖基化位点，其中有lO个糖基化的可能性很高，7个糖熬化程 度一般，6个糖基化程艘较僬。S蛋自共有196个。-磷酸化位点，包括 ％个Ser翥100令Thr粒磷酸纯谴点。赝骞这蟹经点磷酸识戆可缝穗都 不商。s蛋白的39个Cys中只有4个形成二硫键的可能性商。它们分别 是288，725，731，822位的Cys。S蛋白共存在lO个暴露的片段，即 t40，1202—1242。S虽自主要鸯七个萦隶蠖 --690，789--825，1095一l T细胞抗原表位的预测结聚表明，共有11个肽段被预测为HLA—1分子 的混杂性抗琢表位，共有9个敢段被预测为HLA—11分子的混杂憋抗原表 位，菸有7令丸袋段被鞭溅为HLA--A2耱雾控藐嚣表位。B缨熬撬燕 表位预测结果表明，S．鬣自共存在氨基酸残蕊数目不小于7的抗原表位 位点61个。根据B细胞抗原表位预测结果共设计出47个抗原表位多肽， 并合成了35个抗原袁位多肽。用ELISA检测，有六个抗原表位多肽与 SARS瘫复病人盘蘧反应璺疆性臻累，帮S曩s—14、s—17、s一20、N-5 第一军医大学博士论文 和N．19。综合设计的抗原多肽SV．1和SV-5在家兔体内产生了较强的免 疫反应，其免疫后的家兔血清可以检测到SV一1和SV-5的特异性抗体。 SV．7和SV-10产生的免疫反应很弱。 结论：预测和分析了SARS—C