DNA琼脂糖凝胶电泳分析细胞的凋亡与坏死.pptVIP

细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳 武汉大学基础医学院 免疫学教研室 熊 洁 细胞凋亡（apoptosis） 细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。 生物学意义： ①确保正常发育生长：清除多余的细胞 ②维持内环境稳定：清除受损、突变、衰老的细胞 ③积极防御功能：对病毒感染细胞阻止复制 细胞凋亡过程中有一系列特征性的形态学等的改变。其中最重要和最具有特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活而导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成以180~200 bp为最小单位的单体或寡聚体片段。 实验原理 本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺细胞DNA在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。凋亡细胞染色质DNA在核小体连接处断裂，形成180-200 bp或其整倍数的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯状电泳图谱(DNA ladder)，而坏死细胞或凋亡后期的继发性坏死细胞DNA电泳后则成模糊的“涂片状” 。 材 料 1. 凋亡细胞：经地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞 2. 提取DNA：基因组DNA抽提试剂盒（RNA酶、蛋白酶K、悬浮液、裂解液、洗涤液、洗脱液、DNA ladder 标准品等） 3. DNA电泳：1 %的琼脂糖凝胶、点样缓冲液 4. 实验器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、台式高速离心机、65℃水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、紫外透射仪 方 法 一、胸腺细胞的制备： 小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含5－10%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨，将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm，离心5min，制成1×107细胞悬液备用。 二、提取胸腺细胞DNA： ⑴裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液） 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。 (2) 结合DNA阶段(使用到的试剂: 结合缓冲液=B液、3MNaAC, pH4.8) 加入10μl 3MNaAC，随后加入1250μl B液，充分振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次同上，静置1分钟，离心30s。 (3)漂洗阶段（使用试剂：600ul漂洗缓冲液×2=W液） 倒掉收集管中的废液，再加入600ulW液，12000rpm离心30秒。 重复上叙步骤，再次加入600 ulW液，12000rpm离心30秒。 倒掉废液，再次12000rpm离心30秒。 (4) 洗脱收获（使用试剂：50μl洗脱缓冲液=T液） 小心取出离心吸附柱（不可沾上W液，因其中含有乙醇，会使提取DNA变性），将其套入一个干净的1.5ml eppendorf管中，沿吸附柱的正中间小心加入50μl T液，静置1分钟后，于12000rpm离心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因组DNA, 取10μl电泳。 三、DNA琼脂糖凝胶电泳： (5)制板: 将1 %的琼脂糖凝胶加热溶化，取20ml倒板, 待凝, 取梳。置板于电泳槽中，加电泳缓冲液至淹没过胶。 (6) 加样：取50 uL DNA样品与10uL点样缓冲液,混匀, 10ul/孔。（DNA marker 直接加样，5 ul/孔）。 (7) 电泳：点样孔置负极，电压80-100V，电泳至溴酚兰移出2/3距离时，关闭电源。 (8) 观察：取出凝胶板，置紫外透射仪上，可见绿色DNA区带。 注意事项： a 步骤2中，加入B液后一定要充分混匀。离心后，小心取出上清，Tips头不可吸附上白色沉淀（为基因组蛋白）。 b 漂洗阶段（步骤3）一定要离心充分去除漂洗缓冲液，可适当将离心时间延长。 c 洗脱缓冲液一定要保证加入到吸附柱中央。 结果观察 加地塞米松培养的胸腺细胞DNA电泳后呈典型的“阶梯状”条带。未加地塞米松培养的胸腺细胞，DNA无类似改变。细胞坏死对照的DNA电泳呈现弥漫的片状图谱。 地塞米松诱导小鼠胸腺 细胞凋亡 1： DNA marker; 2-3：细胞坏死对照 4-6：细胞凋亡； 7： 正常细胞对照 基因组DNA抽提试剂盒 SDS（十二烷基硫酸钠）：破细胞膜、核膜，使组织蛋白与DNA分离 EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的DNA不再降解 Proteinase K：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为小肽/氨基酸 酚、氯仿：抽提除去蛋白质 异丙醇：沉淀DNA Goldview：DNA萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫外光下呈绿色萤光