蛋白质表达的基本原理及应用.pptVIP

克隆方案I：分泌表达含有天然N端蛋白质 克隆方案II：分泌表达含有非天然N端的蛋白质 克隆方案III：分泌表达C端含有HA-Tag的蛋白质 单柱蛋白纯化 无需蛋白酶 用于蛋白质的连接和特殊标记 用于抗体的分析纯化 多角体蛋白基因的启动子非常强，把目的蛋白的基因接在其启动子后能高水平地表达目的蛋白。构建重组杆状病毒AcMNPV的转运载体和AcMNPV DNA共转染培养的昆虫细胞，几天后可收到目的蛋白。 Pp:多角体蛋白基因的启动子 Pt:多角体蛋白基因的终止序列 MCS:多克隆位点 哺乳动物细胞表达系统最大的优点是能表达翻译后修饰过的外源蛋白 哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长 常用的细胞系有：非洲绿猴肾细胞（COS）、小仓鼠肾细胞（BHK）、人的胚胎肾细胞（HEK-239）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统的表达载体 但是目的基因要接上增强翻译和有助于分泌和纯化的序列： kozak序列（K） 信号序列（S） 蛋白纯化标签（T） 蛋白酶切位点（P） 终止密码子（SC） 5`UTR、3`UTR有助于RNA的稳定性并提高翻译效率 酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组已测序，表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 能将外源基因表达产物分泌至培养基中（分泌型） 不含有特异性的病毒、不产生内毒素，ＦＤＡ认定为安全的基因工程受体系统（Generally recognized as Safe GRAS) 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 酵母菌是最简单的真核模式生物 如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，酵母菌则是最成熟的真核生物表达系统。 酵母菌表达系统 酵母菌表达系统的宿主菌 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的特点： 具有调节型强启动子pAOX1，紧密调控编码乙醇氧化酶基因，在以甲醇为唯一碳源的情况下，细胞内总蛋白中乙醇氧化酶能达到30%，缺乏的情况下，AOX1基因完全关闭 不产生乙醇，可以高密度培养产生大量蛋白 通常也分泌少量蛋白，可以简化分泌型蛋白的纯化 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统的表达载体 整合型表达：单交换（AOX） 整合型表达单交换（HIS） 整合型表达：双交换（AOX） 整合型表达：多拷贝（体内） 体外构建多拷贝目的基因的表达载体 Bgl II A|GATC T T CTAG|A BamH I G|GATC C C CTAG|G PCR引物的设计： 正向引物含有一个Xho I位点和Kex蛋白酶切割位点，随后紧接目的基因的第一个密码子。 反向引物包含有Bgl Ⅱ的识别序列和Stop Code。 K: Lys 赖氨酸，R: Arg 精氨酸 如果目的基因中含有Xho I酶切位点，那么就需要利用载体中的其它位点将该基因与α-MF融合在同一阅读框中。这一克隆方案会在目的蛋白质的N端加入载体编码的氨基酸。选用载体中的多克隆位点Bgl II和Kpn I为例。 K: Lys 赖氨酸，R: Arg 精氨酸 融合蛋白 融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连接起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用： 提高外源蛋白在表达系统中的稳定性 增加外源蛋白在表达系统中的表达量 增加目的蛋白的溶解性 作为抗原的标记蛋白 易于外源蛋白的纯化 融合蛋白作为抗原的标记蛋白 C-myc 标记蛋白 V5 标记蛋白 MBP麦芽糖结合蛋白 Amylose树脂 MBP Factor Xa 蛋白酶切割位点 10 mM 麦芽糖 目的蛋白 融合蛋白易于外源蛋白的纯化 融合蛋白的纯化 非融合蛋白的纯化 原核生物表达系统 原核生物表达系统:大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌 大肠杆菌表达体系的优点： 积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主菌和相应的载体可供选择应用 易于进行遗传操作和高效表达 操作安全，致病能力低 生长迅速,培养代谢易于控制,成本相对低等等 大肠杆菌表达体系的缺点 缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不宜表达真核生物的蛋白 缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构, 常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解 细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜