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第四章 目的基因的制备 4-22 减数杂交分离T细胞受体基因 图4-24 差别显示分析基本流程 * * 一、目的基因 为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的结构基因，创造出有价值的新物种。 生物界的长期进化积累了大量对人类有用的基因，这是一个宝贵的资源。 转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或TAA或TGA)、终止转录区 （1）原核生物基因的组成 基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物： 5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。 原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。 1、结构基因的组成 基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。 编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)： 与RNA聚合酶结合有关 -75区上游有一共有序列GGGCGC (GC框):结合某些转录因子 转录终止区: （3）其他基因组基因的组成 质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。 （2）真核生物基因的组成 2、基因的排列 一般：直线排列于DNA上，且两基因之间有非编码序列。 特例： （1）重叠基因 （2）重复基因 约30%真核基因是多拷贝 （3）加倍基因 较高等的生物基因组是二倍体或多倍体 质粒在宿主内是多拷贝 （3）基因重排 基因组中同一基因簇处于不同细胞而发生基因排列变化 二、目的基因的制备 1、直接分离法 （1）限制性核酸内切酶酶切分离法 已定序（一次或多次酶切、纯化） 已定位（两侧的识别位点酶切） 未定序或无定位（酶切、构建简单文库钓出） （2）基因分离的物理化学法 密度梯度离心法（富含GC的片段浮力密度大） 单链酶解法（富含GC的片段Tm高） 分子杂交法 待分离的基因序列: 转录启动区+编码区+终止区、完整操纵子或基因簇、只具编码序列的基因区、 只含启动子或终止子的DNA片段 2、构建基因组文库分离法 （1）基因组文库的定义 用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。若只储存某生物基因组的部分遗传信息，即构成部分基因组文库。 （2）基因组文库的大小 N=ln( 1-P )/ln( 1-f ) N：文库必需的克隆数 P：文库中目的DNA片段的出现概率 f：插入片段大小/全基因组大小的比值 （3）构建λ噬菌体基因组文库的步骤 获得含基因的DNA片段 与λ噬菌体克隆载体重组 转化受体菌并筛选重组子（见导入受体细胞第五章） 3、cDNA基因文库的构建及目的基因的分离 （1）c DNA文库的概念 直接从生物体分离目的基因很困难，但在某一特定发育期和特定组织仅表达总基因数的15%，据次从分离大大降低难度。 某生物基因组转录的全部或部分m RNA经反转录产生的各种c DNA片段，分别与载体重组而存在于一种受体的群体， 即c DNA基因(部分)文库。 分表达型(如λgt11)：插入片段可表达融合蛋白，有活性、抗原性。 非表达型：适于分离可用核苷酸探针杂交筛选的目的基因 探针(从已知部分蛋白序列推测的人工合成,同种或属的已知序列) 按所用载体分:质粒～(含克隆数少，适于高丰度mRNA) 噬菌体～ (含克隆数多，适于低或极低丰度mRNA) 4、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因 （1）套式PCR （2）反向PCR （3）不对称PCR （4）锚定PCR （5）长程PCR （6）反转录PCR （7）锅柄PCR （8）Alu PCR 5、基因的化学合成 （1）基因化学合成的概况 1979年