细胞培养基本技术-中山大学化学与化学工程学院.pptVIP

细胞培养基本技术 基本概念 原代培养 源自体内新鲜组织的细胞在体外条件下生长，在传代之前称为原代培养。 传代培养 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中 细胞系(cell line) 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。 有限细胞系: 细胞系的生存期有限 无限细胞系:已获无限繁殖能力、能持续生存的 细胞系 （1）只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性－－转化细胞系 （2）不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化 －－恶性转化细胞系 细胞株(cell strain) 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。 在实验过程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期的监控、检测甚至量评估一部分活细胞的情况，包括其形态、结构和生命活动等。这点是其他方法所无法取代的。 进行体外的细胞培养实验时，可以根据需要，控制包括PH、温度、O2张力、CO2张力等物理化学的条件进行实验、观察。 通过细胞培养所得到的细胞系属同一类型的细胞，可以达到均一性。需要时并可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。 通过倒置相差显微镜外接照相,摄影等直接观察活的细胞；电子显微镜分析细胞的超微结构；同位素标记、放射免疫等方法检测细胞内物质的合成、代谢的变化等。 多种学科均可利用细胞培养进行研究，如：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、遗传学、分子生物学等。可供实验的组织来源众多，包括各种动物的各类组织，可以是动物的胚胎或成体，可以是正常组织或肿瘤组织等。 细胞培养可以大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，因此有时可比体内实验经济的多。例如，一个需要100只鼠才能得出结论的实验可能用100片盖玻片或几个多孔培养板而获得具有相同统计学意义的结果。 原代培养细胞的生命归宿 原代培养期 传代期 衰退期 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各种造血系统肿瘤细胞  每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟--4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 培养细胞的生长过程 培养细胞生长的条件 细胞的营养需要 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 无污染 无毒 实验准备 实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 超净台 滤 器 CO2培养箱 培养瓶 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒