第五章酶法分析技术(NO).pptVIP

二、终点法的种类 单酶反应定量法 偶联酶反应定量法 （1 ） 单酶反应定量法 单酶反应只需要一种催化酶，如下式所示 1. 底物减少量的测定 在待测物质为底物的酶反应中，如果底物能接近完全地转化为产物(当有99％转化成产物时，则认为反应完全)，而且底物又具有某种特征性质(如具有特殊的吸收光谱)时，就有可能直接测定底物的减少量而定量待测物。 2. 产物增加量的测定 在被测物作为底物的酶促反应中，如果底物基本上都能转变成为产物，而产物又具有可专一性进行定量测定的物质，那么，根据产物的增加量就能检测底物的量。 转换反应 循环反应 指示反应 * 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 　 临床生物化学检验 （第二版） 第五章　代谢物酶法分析技术 * 第五章 酶法分析技术 酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。 酶法分析技术的概念 酶法 以酶为分析对象的分析方法 ——酶活力测定法 以酶为分析工具或分析试剂的分析方法 ——酶分析法 原理和方法：以酶能专一而高效地催化某些化学反应为基础，通过对酶反应速度的测定或生成物等浓度的测定而检测相应物质的含量。 酶作用的特异性高 试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。 酶法分析主要优点 酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法 酶法分析的方法 2 酶法分析 终点法 反应速率法 酶法分析的理论基础 1 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????? 可以看出整个反应过程，可以大致分为二个时期。一开始为动态期，化学反应按一定速度进行，反应物浓度随时间而变化，且变化程度不断变小，到一定时间，化学反应或者达到平衡，或者反应达到终点，此时反应速度为零，反应物浓度不变。按所用方法所测定的反应是在达到平衡前还是平衡后。分别命名为动态法或平衡法/终点法。 终点法又称为总变化量法，先借助酶反应(单独的反应或几种酶构成的稠联酶反应)使被测物质定量地进行转变，在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质(第二底物)等的变化量，因此称为终点测定法(end-point method)。 终点法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。 终点法基本理论 (1) 用这种反应作底物定量时，可以测定底物的减少量，也可以测定产物的增加量。对含有辅酶的酶，测定辅酶的变化量也是有效的方法。 单底物反应直接测定法 尿酸 + O2 + H2O 尿囊素 + CO2 + H2O2 胆绿素+ H2O 胆红素 + O2 尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在293 nm 处测定吸光度下降 胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在450nm处测定吸光度下降 尿酸紫外法测定 胆红素测定 草酸 甲酸 + CO2 草酸的测定 瓦式呼吸计测定生成的CO2的量 酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。 最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。 酶偶联法 (2) 脱氢酶指示系统 氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰. 脱氢酶指示系统 以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶Ⅰ(NAD+) 或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处吸光度的下降来计算被测物的浓度。 脱氢酶指示系统 血清葡萄糖己糖激酶法测定 Glu + ATP G-6-P+ADP G-6-P + NADP+ P-6-GA + NADPH + H+ 指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比 脱氢酶指示系统 血清尿素测定 尿素 + H2O 2NH3 + CO2 NH3 + α-酮戊二酸 + NADH + H+ 谷氨酸 + H2O + NAD+ 测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定 常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹