烟草及烟草制品 质体色素的测定 高效液相色谱法 研究报告.docVIP

烟草及烟草制品 质体色素的测定 高效液相色谱法烟草所含的色素可依据不同的颜色、性质和对烟草品质的影响，分为三大类：绿色素、黄色素和黑色素。绿色素主要是叶绿素（Chlorophyll）；黄色素主要是胡萝卜素（Carotene）和叶黄素（Lutein），统称类胡萝卜素；黑色素主要是多酚的酶促棕色化反应和非酶棕色化反应（Maillard反应）产生的醌类和杂环类混合物。通常所说的烟叶质体色素，存在于烟叶植物细胞中细胞器的质体中（其中的叶绿体和有色体），主要包括新黄质、紫黄质叶黄素、叶绿素a、叶绿素b、β胡萝卜素等。β-大马酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等都是烟草中特别重要的香味物质．调制后烟叶中的类胡萝卜素主要是β-胡萝卜素和叶黄素，叶黄素是胡萝卜素的含氧衍生物。烟叶在调制、加工与陈化过程中色素降解完全和得当，会使烟叶香气增加，色泽鲜亮，提高烟叶的品质和可用性。因此研究烟叶中质体色素对烟草制品的生产和品质提升具有重要的实际意义。烟草质体色素的萃取通常用含丙酮的溶剂。赵世杰等研究不同萃取方法对测定结果的影响：方法一为80％丙酮萃取后定容，加水后用乙醚萃取；方法二为用水浸泡萃取后，残渣用80％丙酮萃取。结果表明，鲜烟叶可直接用80%丙酮萃取测定；调制后的烟叶经水浸提后，再用80%丙酮萃取其中的叶绿体色素（或用80%丙酮萃取全部色素，再用乙醚萃取色素）进行测定。邱玲、时亮等在测定烟叶β-胡萝卜素时用90%丙酮与烟叶样品一起研磨，减压过滤并冲洗数次，加水后用苯萃取。杜咏梅等在90%的丙酮溶液浸提鲜烟叶色素的基础上，用氢氧化钾的甲醇溶液将叶绿素及叶黄素的酯皂化，形成溶于水的盐，再用乙醚萃取类胡萝卜素。刘国顺等则用加过0.1%BHT的丙酮溶液进行研磨萃取，然后加入0.1g醋酸铅，于4℃下以10000r/min离心5min以除去蛋白质。最近研究较多的方法是90%丙酮振荡萃取后，取部分萃取液稀释后过Sep-Park-C18固相萃取小柱预分离和富集烟草色素（小柱先用15甲醇活化，再用30水洗去小柱上残留的甲醇）经典的植物色素测定方法是分光光度法，早先测定烟草色素基本采用该法。分光光度法一般是用波长扫描、经验公式计算得到烟草中各种质体色素的含量，或在445nm下测定总类胡萝卜素含量。此法操作步骤繁琐、耗时、试剂消耗大结果重现性差。邱玲等使用层色谱扫描法测定β-胡萝卜素。通过文献调研我们发现，高效液相色谱法分离分析烟草色素是近年来使用较多的方法。目前使用最多的测定烟草中质体色素的方法是流动相采用1：1的甲醇和异丙醇与水梯度洗脱，而分析检测的质体色素大多是其中含量较高的如β-胡萝卜素和叶黄素等。β-胡萝卜素β-胡萝卜素α-胡萝卜素Tsao, R等采用高速反流色谱萃取纯化万寿菊、南瓜和土豆中的叶黄素、紫黄质和β-胡萝卜素Larsen 等采用丙酮萃取绿色蔬菜中的类胡萝卜素β-胡萝卜素使用甲醇异丙醇水梯度洗脱时，新黄质和紫黄质分离不好，分离度不高。由于这两种色素的含量较低，采用该方法对这两种质体色素进行定量显然不够准确。 2. 实验 2.1材料和仪器 （1）试剂。乙腈,异丙醇（色谱纯，Fisher公司），纯度不小于99.9%。丙酮（分析纯，天津北方化学试剂有限公司），纯度不小于99.0%； （2）标样仪器.0001g，瑞士梅特勒μm微膜过滤器（Millipore公司）； 2．2样品的处理与分析 调制后样品和卷烟制品按YC/T31-1996制备试样。新鲜烟叶由冻干机-45℃冻干48h，粉碎，过40目筛，取筛下物放入冰箱冷藏待用。 准确称取制备后样品(新鲜烟叶0.2g左右，调制后及卷烟制品烟叶取2g左右，精确至0.0001g）于50ml三角瓶中，准确加入25ml萃取剂（90%丙酮溶液），室温下超声波萃取20 min，取适量萃取液经0.45μm微膜过滤器过滤。滤液装入2ml棕色色谱瓶，待HPLC分析。 采用的分析条件为：色谱柱：Waters Nova-Pak-C18（3.9×150mm，4μm）；柱温：40℃；柱流速：0.5 mL/min；进样量：10μL；流动相A：异丙醇；流动相B：80％乙腈的水溶液（V/V）；平衡时间：6min；梯度洗脱，条件如下： 表1 流动相的淋洗梯度 时间(min) %B 流速(ml/min) 0 100 0.5 40 0 0.5 检测波长：450nm。采用保留时间定性，外标法定量。 3 结果与讨论 3．1 色谱条件的选择 3．1．1 流动相的选择 采用Waters Nova-Pak-C18柱，使用传统的流动相甲醇-异丙醇-水体系，得到的色谱图如图1。由图1可以看出，新黄质和紫黄质没有完全分离。 新黄质和紫黄质结构如图2所示。其结构相似，只相差2个氢原子，难以分离。试验采用甲醇-乙腈-水体系梯度洗脱，新黄质和紫黄质的分离度可以达