第五章2分子生物学研究法(上).pptVIP

（2）SNP概述 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300～1000个碱基对中就有1个，估计SNP总数至少可达300万个。 位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP位点被称作单倍型 。 （4）SNP的应用 A.人类基因单倍型图的绘制 B. SNP与疾病易感基因的相关性分析 C.指导用药与药物设计 通过检测SNP的遗传多态性标记揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异的原因 双向电泳（two dimension electrophoresis，2－D）是分离混合蛋白质最常用的方法。 双向电泳由两部分构成：等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。 该方法是依赖于蛋白质的等电点的不同和相对分子质量的不同而构建的。 图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。 5、基因的图位克隆法 基因的图位克隆法是利用表型分离未知性状目的基因的一种好方法。 首先，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的分子标记。通过对许多不同的生态型及分子标记的分析，找出与目的基因距离最近的标记，将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。在作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cm（厘摩）相当于1%的重组率。 Col0 诱变 繁种 淘汰致死突变和不能繁殖突变 筛选突变体 处理 Landsberg野生型 × 确定突变体是否是单基因突变及显隐性 突变体筛选 基因图位克隆 a a A A × Col-0突变体 Landsberg野生型 F1 a A × 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 a A a A A A a a F2 粗定位 a a a a a a a a maker Col-0 Ler 单交换 双交换 不交换 不交换 重组率＝ 单交换＋2×双交换 2×样品总数 ×100％ Col-0 Ler Col-0 Ler 在15个maker中，重组率最小者距目标基因最近 细定位 a 粗定位maker 细定位maker 细定位maker 在3个maker中，重组率最小者目标基因距该maker最近 循环若干次 六、蛋白质组与蛋白质组学技术 蛋白质组：一个物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质。 蛋白质组学：指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、蛋白质的翻译后修饰及蛋白质功能确定等。 1、双向电泳技术 * 第五章 分子生物学研究法（上） 一、重组DNA技术发展史 二、DNA基本操作技术 三、RNA基本操作技术 四、SNP的理论与应用 五、基因克隆技术 六、蛋白质组与蛋白质组学技术 1、用内参基因的CT值确定目标基因的CT值： ΔCT (test)= CT (target,test) – CT (ref,test) ΔCT(calibrator)= CT (target, calibrator) – CT(ref, calibrator) 2、用校准样本的ΔCT值确定试验样本的ΔCT值： ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator) 3、计算表达水平比率： (1+E) –ΔΔCT=表达量的比值 三、定量PCR: 相对定量分析法：-ΔΔCt法 1、用内参基因的表达量确定目标基因的表达量： 2、试验样本的表达量除以校准样本的表达量 －△△CT方法的推导 PCR 指数扩增的公式是： 这里，Xn 是第 n 个循环后目标分子数，X0 是初始目标分子数，Ex 是目标分子扩增效率，n 是循环数，C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。 因此： X T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。C TX 是目标分子扩增达到阈值时的循环数。Kx 是一个常数。 对于内参反应而言，也有同样的公式： 用XT 除以RT 得到： 假设目标序列与内参序列扩增效率相同： 或： XN 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△CT表示目标基因和内标基因CT值的差异（CTX－CTR ）整理上式得： 最后用任一样本q 的XN 除以参照因子（calibrator, cb）的XN得到： 分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质