生物素标记寡核苷酸探针原位检测石蜡切片鸭瘟病毒核酸.pdfVIP

中国兽 医学报 2009年4月 第29卷 第4期 ChinJVetSciApr．2009 Vo1．29 No．4 403 生物素标记寡核苷酸探针原位检测石蜡切片鸭瘟病毒核酸 程安春 ，廖永洪 ，汪铭书 ，袁桂萍 ，徐 超 。，韩晓英 ，郭宇飞 。 (1．四川农业大学 动物科技 学院禽病防治研究中心，四川 雅安 625014；2．四川省动物疫病与人类健康重点实验室，四川I雅安 625014) 摘要：据 GenBank中有关鸭瘟病毒 (DPV)的 1个765bp的EcoRI片段序列，用 Oligo软件设计长度为 37bp的寡 核苷酸并用生物素标记制备探针 ，经 blast分析和斑点杂交检测探针 的特异性后 ，建立从石蜡切片中检测 出DPV 核酸的原位杂交方法并对人工感染死亡鸭的各组织器官进行检测 ，结果显示 ：(1)寡核苷酸探针能特异性检测到 DPV强毒 CHv株DNA，对鸭病毒性肝炎病毒 QL79株 RNA、血清 1型鸭疫里默 氏杆菌DNA、鸭源多杀性巴氏杆 菌 DNA、鸭沙门茵 DNA和大肠杆菌DNA的检测结果为阴性 。(2)以寡核苷酸探针建立的从石蜡切片中检测 出 DPV核酸 的原位杂交方法的最佳反应条件为 ：组织切片先用 0．2mol／LHC137℃处理 2Orain，然后用 i00mg／L 的蛋 白酶 K37℃消化 15rain左右 ；杂交时探针工作浓度为 350btg／L；Avidin-AP的工作稀释度为 l：100。(3)以 所建立的原位杂交法检测 DPV-CHv强毒人工感染死亡鸭的各组织器官，结果肝脏 、肠道 、法 氏囊、脾脏 、食道 、肺脏 扣肾脏呈阳性反应，DPV的DNA分布于特定细胞的细胞浆和细胞核。结果表明，原位杂交检测石蜡切片中DPV 的方法具有直观、特异性强的优 点，是对 DPV进行检测和病原定位 的 良好方法 ，可用于 DPV 的侵染过程和致病机 理研 究及回顾性诊断检测 。 关键词 ：鸭瘟 强毒 ；原位杂交 ；检测 ；分布 中图分类号：$852．65 文献标识码 ：A 文章编号：1005—4545(2009)04—0403—06 Studiesontheinsitudetectionofduckplaguevirusnucleicacidinparaffinsection bybiotin labelledoligonucleotideprobe CHENG An—ehun’，LIAO Yong—hong ，W ANG M ing—shu’ ，YUAN Gui—ping’，XU Chao，， HAN Xiao—ying，GUO Yu—fei (1．CollegeofAnimalScience VeterinaryMedicine，Si- chuanAgriculturalUniversity，Yaan，Sichuan625014，China；2．KeyLaboratoryofAnimal DiseaseandH manHealthofSich甜anProvincg，Yatan，Sichan625014，China) Abstract：Toestablishmethodsthatcouldbeemployedtostudythepositionofduckplaguevirusnucleicacidin paraffinsectionsothateffectivemethodcouldbeusedinduckplaguevirusinfectivityandpathogenesisinvestigation andlookingbackdiagnosis．Duckplaguevirusnucleicacidinsitudetectionmethodwasestablishedafterthespecifici— tyofabiotinlabelled37bpoligonucleotideprobewhichwasdesignedbythesoftwareofOligoaccordingtoa765bp EcoR I digestedDPV DNA fragmentsequenceinGenBankwasverifiedbyblastanalysisanddo