苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因在虫生真菌球孢白僵菌中的表达的研究.pdfVIP

摘要 真菌杀虫剂具有效费比高、安全性好、能够发挥持续控制效果并且易于人工 培养等优点,但存在受环境影响较大、杀虫效果慢和效果不稳定等弱点, 因而一定 程度上限制了其大规模应用。为此人们一直在潜心研究虫生真菌的致病分子机 制，以寻找可通过基因工程手段进行改造的基因。 苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，在菌体的稳定生长期可形成伴胞晶体蛋白 (parasporal crystal protein) ,又称杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein , ICP) 或 δ- 内毒素，是一类对害虫毒力强、致死速度快且对害虫天敌无毒性的昆虫病原微 生物，昆虫病原细菌苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因表达的杀虫效果非 常好，但能否增强真菌的毒力尚不清楚。本研究将外源的苏云金芽孢杆菌的毒力 基因Cry1Ac分别转入重要虫生真菌球孢白僵菌的 两个野生型菌株：马尾松毛虫 分离株RCEF0013 ，以及玉米螟分离株RCEF3383 ，以构建两个单拷贝的Cry1Ac 超表达转基因工程菌株。本实验首先构建了含有筛选标记bar基因和外源基因 Cry1Ac的载体pbarGPE1-Cry1Ac，通过芽生孢子法将载体质粒转入该野生型出发 株RCEF0013和RCEF3383 ，在加入草胺磷 （100g /ml ）的SDAY培养基上筛选获 得转化子，获得了一价转Cry1Ac基因的工程菌株RCEF0013-G1和RCEF3383-G1, 从而使该Cry1Ac基因在转化的菌株中得到超表达。 对马尾松毛虫 （Dendrolimus punctatus ）进行生物测定的结果显示，工程株 Bb13-G1对马尾松毛虫的LC25 比出发株降低5.4倍，LD25减少7.1倍，LT25缩短2.2 d， 说明其对马尾松毛虫的侵染毒力明显提高；喂食处理和虫体喷雾喂食结合处理与 单纯虫体喷雾处理相比，累计致死率分别提高了55.6%和63.0%，致死中时分别 缩短了4.5 d和5.3 d 。实验结果表明苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因在白 僵菌Bb13 中成功表达其胃毒作用效果明显，提高了球孢白僵菌的毒力。这是 Cry1Ac基因首次在虫生真菌中表达。 对玉米螟 （Ostrinia furnacalis）进行生物测定的结果表明，工程株 Bb1944-G1 8 喷雾处理组的LC50 和 LD50 比出发菌株Bb1944 分别降低 5 倍和 7.2 倍；在 2×10 孢子/ml 浓度下工程株喷雾组的LT50 比出发株缩短 1.7d，说明其对玉米螟的侵染 毒力明显提高。 两个菌株的毒力测定都说明 Cry1Ac 基因在转入白僵菌后得到了表达，使得 工程菌对松毛虫和玉米螟的毒力明显增强。 关键词：球孢白僵菌，转基因，Cry1Ac基因，载体构建，毒力，马尾松毛虫，玉 米螟 I Abstract Fungal insecticides is a sort of environmental friendly environmentally safe biopesticide, with good safety to human, vertebrates and non target invertebrates, and substantial sustainable control effect, and easiness of mass production with artificial media. On the other hand, they are subjected easily to environmental factors and kill insects slowly and not steadily, which has constrained the development of the use of the fungi. Moleculer pathogenic mechanisms have been studied in o