态弧菌OmpU抗原B细胞线性表位的筛选与鉴定的研究.pdfVIP

摘要 拟态弧菌(Vibrio mimicus,Vm )是一种水产养殖动物和人共患病病原菌。该菌 不仅可引起水产养殖动物严重的腹水病，而且可通过水体和水产品感染人类，导 致人类腹泻和食物中毒[1-6]。针对腹水病已成为制约水产养殖业健康发展的现状， 开展该病快速诊断方法的研究以及研制其有效疫苗具有十分重要意义，而筛选出 理想的侯选抗原或抗原表位则是急需解决的首要问题。本研究联合采用表位预测 和实验验证方法对拟态弧菌OmpU蛋白B细胞线性表位进行筛选鉴定，并分析表 位间的免疫活性差异，为建立基于抗原表位的快速诊断方法和研制表位疫苗奠定 基础。 首先，通过生物信息学软件 DNAStar Protean 综合分析 OmpU 蛋白的二级结 构、柔性区域、表面可及性、亲水性和抗原指数，预测 OmpU 蛋白可能的 B 细 胞线性表位。在应用 Moe2008 软件构建 OmpU 蛋白三维结构（3D ）的基础上， 利用 Synchronize 可视化程序将 10 个预测表位肽序列展示于 OmpU 蛋白 3D 结构 上，筛选出位于 3D 结构表面的 7 个肽段作为最可能的 B 细胞线性表位，并进行 生物合成，用于鉴定。 其次，将 OmpU 蛋白主要抗原域基因 OmpUa 亚克隆至表达载体 pAML-c4x 中进行诱导表达与鉴定，分析重组蛋白的表达形式。根据pAML-c4x 表达载体阅 读框的要求，设计 1 对包含 Sal I 和 Hind III 酶切位点的特异引物，以拟态弧菌 基因组 DNA 为模板，扩增 OmpUa 基因，将 OmpUa 基因克隆至 pMD-18T 载体 中构建重组克隆质粒pMD-18T-OmpUa。pMD-18T-OmpUa 经 Sal I/Hind III 双酶 切后，将 OmpUa 基因亚克隆至表达载体 pAML-c4x 中构建重组表达质粒 pAML-c4x-OmpUa ，并转化至大肠杆菌 TB1 。基因工程重组菌 pAML-c4x -OmpUa/TB1 经 IPTG 诱导表达后，收集菌体蛋白进行 SDS和 Western-blot 鉴定，SDS结果显示出现一条与预期融合蛋白 MBP-OmpUa 相对分子量大 小相同的浓染蛋白条带；Western-blot 结果显示重组融合蛋白能被兔抗 MBP 抗体 所识别。这些结果表明 OmpUa 基因在原核细胞中得到成功表达。基因工程重组 菌 pAML-c4x-OmpUa / TB1 经 16℃诱导表达后，分别提取胞内可溶性部分和包 涵体进行 SDS分析，结果显示重组融合蛋白主要以可溶性形式表达。 再次，以纯化的重组融合蛋白 MBP-OmpUa 为抗原制备特异性抗体。重组 融合蛋白 MBP-OmpUa 经麦芽糖直链淀粉树脂纯化后，与双相乳化佐剂充分乳 化制成免疫原，并按照一定的免疫程序免疫家兔制备兔抗 MBP-OmpUa 抗体。 结果发现在免疫后第 14 天即可检测出血清特异性抗体，免疫后第 28 天血清抗体 I 的ELISA 效价达到 1:4096000，琼扩效价达到 1:32，完全可以满足后续实验的要 求。 最后，采用肽 ELISA 方法鉴定预测表位肽，分析不同表位间免疫反应性的 大小。以 40μg/ml 预测表位肽及一个无关肽为包被抗原，以 1:400 稀释度的兔抗 MBP-OmpU 抗体、兔抗MBP 抗体及阴性血清为一抗，1:7000浓度羊抗兔HRP-IgG 为二抗，采用间接 ELISA 方法检测各预测表位肽的免疫反应性。结果显示 7 个 预测表位肽均能与兔抗 MBP-OmpUa 抗体发生结合反应而不能与兔抗 MBP 抗体 发生反应，而序列无关肽与上述两种抗体均不发生反应，表明 7 个预测表位肽均 能被兔抗 MBP-OmpUa 抗体特异性识别，它们保留了天然 OmpU 蛋白的免疫反 应性，是 OmpU 蛋白的真正表位。7 个表位的免疫反应性大小依次为表位 3 （aa90-98 ）、表位4 （aa239-250 ）、表位6 （aa183-195 ）、表位2 （aa117-126 ）、 表位 1 （aa25-33 ）、表位5 （a