枯草杆菌 RecQ 解旋酶精氨酸指与 HRDC 结构域的功能研究.pdfVIP

摘要 RecQ 解旋酶是一种重要的大分子代谢物质，对维持遗传物质的稳定性起到 关键作用。研究发现RecQ 解旋酶参与多种代谢过程，如DNA 复制、修复、转 录重组、核糖体组装、RNA 拼接、蛋白翻译，端粒稳定等。虽然目前发现的RecQ 解旋酶种类越来越多，但这类酶在其氨基酸序列上是具有一定的保守性，可选用 具有典型功能结构域的模式生物RecQ 酶作为研究对象，对其蛋白结构与功能开 展研究工作。本文以枯草杆菌（Bacillus subtilis ）RecQ 解旋酶为研究对象，研究 其RecQ 的蛋白结构与酶生化活性的相互关系，以揭示RecQ 解旋酶的分子运作 机制。本实验室前期工作发现枯草杆菌具有两种天然异构体（本文命名为 B.subtilis RecQ L 和B.subtilis RecQ S ）：一个含HRDC 区域，另一个则缺失。因 此可利用这种特性来进行研究。本实验以 Bacillus subtilis 168 中抽提的基因组 DNA 和质粒B.subtilis RecQ L-pET15b 为模板，PCR 扩增分别得到大小为1.5kb 和1.8kb 的B.subtilis RecQ S 和B.subtilis RecQ L 的全基因片段，并用重叠PCR 定点突变法将两种 RecQ 基因片段中的两个精氨酸残基分别进行单突变和双突 变，并将野生型和突变型基因克隆入原核表达载体pET24a （+ ）中，连接产物转 化入感受态E.coli DH5α 。挑取单菌落，培养后提取质粒，经菌液PCR 和双酶切 鉴定，并测序正确后，转化大肠杆菌E.coli BL21 （DE3 ），用IPTG 进行低温诱 导表达，结果发现所有目的蛋白主要以可溶形式存在于菌体中。优化表达条件后， 经亲和层析纯化获得纯度大于90%的目标蛋白质，检测野生型和突变型蛋白的生 化活性。结果表明，Bacillus subtilis RecQ 解旋酶具有DNA 依赖性和蛋白浓度依 赖性的ATP 水解活性。两个精氨酸残基突变后，RecQ 酶的ATP 水解活性明显减 弱，表明这两个精氨酸残基参与RecQ 酶与ATP 的相互作用。然后采用ATP 水 解活性抑制剂—原钒酸盐（Vi ）来确定枯草杆菌 RecQ 解旋酶中的精氨酸指位置， 通过实验可确定B.subtilis RecQ S R322 和B.subtilis RecQ L R323 为精氨酸指结 构。为了能够更加直观观察RecQ 酶与DNA 的相互作用，本实验使用EMSA 和 荧光偏振法的方法来进行检测。但由于 EMSA 的灵敏度不高，则通过灵敏度更 高的荧光偏振法来检测枯草杆菌RecQ 解旋酶精氨酸突变体的DNA 结合活性。 实验证明Bacillus subtilis RecQ 解旋酶对DNA 的结合活性具有蛋白浓度依赖性。 将精氨酸残基突变后，可能影响了DNA 结合到RecQ 酶上的能力，说明R3 19， R322 ，R320 和R323 都参与RecQ 酶与DNA 的相互作用，此精氨酸残基能促进 RecQ 酶对DNA 的结合作用。本文还采用FRET 原理来测定DNA 的解旋活性， 退火活性以及ATP 结合活性。将精氨酸残基突变后，Bacillus subtilis RecQ 酶对 DNA 解旋和ATP 结合活性明显降低，说明此精氨酸残基能促进RecQ 酶对DNA 解旋和ATP 的结合作用。但是对于DNA 的退火活性只是在一定程度上受到影响， 说明精氨酸残基并不参与酶对 DNA 的退火配对作用。除此之外，本文还将 Bacillus subtilis RecQ L 中的HRDC 区域进行截断，并将该基因进行克隆，克隆 完成后，进行蛋白表达和纯化。实验结果说明HRDC 区域对枯草杆菌RecQ 解旋 酶的各种生物活性起到辅助作用。本实验的意义在于为研究RecQ 解旋酶家族其 他重要成员的活性功能提供了理论依据。 关键词：RecQ 解旋酶；枯草杆菌；蛋白表达；蛋白纯化；精氨酸指；HRDC 结构域 Abstract RecQ helicaeses are one of the most important macromolecules in the process