枝角类衰老相关蛋白基因和表皮蛋白基因的克隆及表达分析.pdfVIP

摘 要 枝角类的生活史特殊, 具有孤雌（无性）生殖和两性（有性）生殖两种方式。 通常在外界条件比较适宜时, 行孤雌生殖（无性生殖）; 当环境因素胁迫, 如温 度变化, 食物匾乏, 水溞密度过大等导致生存环境不利时, 生殖模式即过渡为有 性生殖, 当环境适宜时休眠卵再萌发产生孤雌溞, 以保持枝角类种族的延续。针 对枝角类在生殖生物学方面的研究, 主要集中在生态因子对枝角类生殖转化的 影响, 对枝角类生殖转化分子机理方面的研究较少。因此，研究明晰枝角类繁殖 的转换机制, 具有重要的理论意义, 同时可实现人工控制枝角类的繁殖改变, 在 水产养殖业上具有广泛应用价值。 本研究首次克隆得到蚤状溞衰老相关蛋白DpSAP基因cDNA和隆线溞表皮蛋 白CP基因cDNA全长序列。蚤状溞DpSAP基因编码117个氨基酸; 生物信息学分析 显示, DpSAP 蛋白包括一个N-糖基化位点, 无信号肽; 多序列比对分析表明, 蚤 状溞DpSAP 基因编码的氨基酸序列与其他物种的同源基因编码的氨基酸序列相 似性较低; 系统进化树分析结果显示, DpSAP 与其它物种SAP距离较远。导致以上 结果可能是针对甲壳动物SAP基因的研究较少有关。隆线溞CP基因编码219个氨 基酸; 生物信息学分析表明, CP蛋白包含一个由15个氨基酸组成的信号肽, 一个 Chitin_bind_4结构域, 不含明显的活性位点; 多序列比对分析显示, 隆线溞CP和 大型溞的同源性最高, 与其它物种CP相比较同源性较低。系统进化树分析显示, 隆线溞CP蛋白的进化地位与其生物学分类地位相吻合。以上结果都证明了本文 获得的隆线溞CP基因cDNA全长的正确性。 实时定量PCR分析发现, DpSAP基因在两性溞中表达量最低, 在早期两性雌 溞中表达量最高。DpSAP在孤雌幼溞和后期两性雌溞中的表达量有显著差异, 在 成年孤雌溞和早期两性雌溞中的表达量具有极显著差异, 这揭示了DpSAP 基因 很可能跟蚤状溞的生殖转化过程相关。RT-PCR半定量结果表明, CP基因在孤雌 溞与两性溞体内均可以进行表达, 然而, 在两性溞体内该基因表达量显著高于孤 雌溞体内的表达量, 这表明CP基因很可能在隆线溞生殖转化中发挥作用。 I 本研究利用整体原位杂交技术对枝角类生殖转化相关功能基因DpSAP 和CP 在孤雌溞和两性溞中进行了定位分析, 在蚤状溞孤雌溞和两性溞中, SAP基因都 是在溞体第二触角关节处表达, 这暗示着DpSAP 基因很可能参与了蚤状溞的生 殖转化过程; 在隆线溞孤雌溞和两性溞中, CP基因表达的部位不同, 而且在两性 溞中的表达量要比孤雌溞中的多, 这与CP基因的半定量RT-PCR实验结果相一致, 也说明CP基因很可能在隆线溞生殖转化过程中起一定作用。 关键词：枝角类; 生殖转化; 衰老相关蛋白DpSAP 基因; 表皮蛋白CP 基因; 克 隆表达; 原位杂交 II ABSTRACT The natural history of cladocerans is particularly unusual among animals, as they undergo both sexual and asexual reproduction. Reproduction is generally asexual in favorable en