产纤维素酶霉菌的筛选.5.docVIP

产纤维素酶霉菌的分离和筛选 班级:09生物技术 指导老师：黄志华 组别: 第五小组 组员：吴志娟、戴剑鹤、柯佳宝、潘凯仑、王志辉 （24-29号） 组长：吴志娟 一．实验目的 1.进一步复习生物化学、微生物学等相关专业知识。 2.掌握产纤维素酶细菌的筛选、纯化和保藏的方法。 3.学会设计实验计划。 4．综合培养动手操作能力及创新精神。 二. 实验原理 纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源,透明圈直径和鉴定板孔径大小的比值能够直接反映该霉菌产纤维素酶的能力,其原理是刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂,染色之后能和纤维素结合形成红色,产纤维素酶霉菌在培养基平板上培养后产的生纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖纤维二糖,在用刚果红染色之后没有被水解的纤维素能够和刚果红结合显红色,而水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈。 三．实验器材与试剂 1.样品：后山植物林地土壤，于地下8cm左右。 2.培养基： （1）富集培养基：配制查氏硝酸钠g 、磷酸氢二钾1g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g 氯化0.5g 、硫酸亚铁0.01g 蔗糖30g 琼脂20g 加水1000mL(CMC—Na培养基): 羧甲基纤维素钠(CMC—Na) 15g、NH4NO3 1g、酵母膏1g、MgSO4 0.5g、KH2SO4 1g、H2O 1000ml，ph调节至7.0，121?C灭菌25min。 （3）斜面保藏培养基：硝酸钠3g 磷酸氢二钾1g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g 氯化0.5g 、硫酸亚铁0.01g 蔗糖30g 琼脂20g 加水1000mL(CMC—Na) 3.6 g、(NH4)2S04 2 g，MgS04·7H20 0．5 g，KH2PO4 1 g，NaCl 0．5g，刚果红0．4 g，琼脂20 g，加水至1000 mL， pH调至7.0，121℃，灭菌20min 3.器材 ：小铁铲和无菌纸或袋（可省）、培养皿6个、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管5支（每支4.5mL水）、烧杯3个、三角瓶5个、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头10个）、天平、滤纸、pH试纸等。 四．实验步骤 1.培养基的制备： 霉菌分离、指示菌培养基都为查氏培养基。通过称量、加热溶解、调节pH等步骤，并配制 50 mL无菌水（内装几颗玻璃珠） 2瓶 4.5mL无菌水若干支。 121℃灭菌20min）选择有明显透明圈的菌落的平板，无菌条件下，用接种针挑取单菌落CMC—Na培养基B）上，37 ℃ 条件下,倒置培养48h左右，直到得到纯菌落为止。在无菌条件下，将所得接种于斜面氏中培养48h ,然后4 低温保存，以备后用。