实验四外源基因的表达.pptVIP

实验五 综合实验  外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测 实验目的 通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法； 了解SDS的制备及其分离原理。 一、原核表达实验原理 将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖 )，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS检测。 原核细胞表达系统 常见的原核表达载体有：非融合表达蛋白载体pKK223-3、分泌型克隆表达载体PINⅢ系统、融合蛋白载体pGEMX系统、融合蛋白表达系统pET系统等。 外源基因在原核生物中表达的注意事项： （1）??? 通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白： （2）??? 外源基因不能带有间隔序列（内含子），因而必须用cDNA或化学合成的基因，不能用基因组DNA （3）??? 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件调控外源基因的表达 （4）??? 外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架 （5）??? 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止表达的外源基因产物对宿主的毒害。