油菜黄化突变体叶绿体发育特性研究.pdf

油菜黄化突变体叶绿体发育特性研究 生物化学与分子生物学专业 研究生:陈云伟 指导教师:杜林方教授 叶绿体的生物发生是植物生物学中一个重要的研究领域，这些光合器官的发 育主要从结构、生化、遗传和分子水平上进行研究。本论文以油菜黄化突变体 Cr3929为材料，研究了不同生长时期不同器官的基因表达、色素蛋白含量、叶绿 素光谱吸收、LHCII的蛋白含量及组成、类囊体膜的室温荧光光谱、CD谱、DCIP 活性和多聚核搪体等。 首先，分析了叶绿体重要外被膜转运蛋白Toc33/Toc34的表达。通过蔗糖梯 度和差速离心制备生长60天的油菜突变体及其野生型的叶绿体被膜，利用SDS 变性胶分离叶绿体被膜蛋白，以拟南芥Toc33蛋白抗体免疫印迹分析Toc33/34 蛋白含量的变化，结果显示:无论是在野生型还是突变体油菜被膜中仅能检测到 Toc33，并且在二者中的表达差异并不明显，仅在突变体中有很少的增加。以我 们自己克隆得到的油菜Toc33基因为探针，检测了突变体及野生型油菜下胚轴和 子叶中Toc33mRNA水平上的差异，结果显示:Toc33基因在突变体油菜子叶中转 录本水平较之野生型差别很小，在子叶和下胚轴中Toc33具有差异表达。表明: 叶绿体外被膜转运机器重要结构组分Toc33/Toc34在突变体中的表达没有差异。 第二，分析了突变体与野生型油菜生长30天的幼苗不同器官全蛋白和叶绿 素的含量，结果显示:(1)突变体幼苗中全蛋白与叶绿素含盘都减少，360-720nm 光谱吸收也显示突变体中吸收峰值降低，以相同鲜重上样SDS分析结果与 蛋白定量分析一致，相同鲜重突变体全蛋白含盘较低;(2)突变体油菜具有较高 的。hla/chlb比值，但在不同器官存在差异:子叶中增加30%，下胚轴中增加 20Yo;(3)相同鲜重上样，突变体全蛋白中LHC工工含量在子叶和下胚轴都降低， 但以相同蛋白计，突变体下胚轴中LHCII含量明显高于其在野生型中的含量;(4) 林可霉素处理3-6小时导致chl含量在野生型油菜子叶中降低，突变体子叶中 I 相反，chla和 chlb也呈现出相同的变化趋势，chla/chIb在突变体中增加，在 野生型中先 (3h)升高又降至 (6h)低于未用林可霉素处理的水平。我们推测突 变体中chla向chlb的转化效率降低，导致chlb的含量下降，进而导致chlb结 合蛋白迅速降解而使积累水平降低。 第三，借助于叶绿素光谱吸收、室温荧光光谱、SDS,LHCI工的Western 印迹、CD谱和DCIP活性测定等方法，对突变体与野生型油菜不同生长时期幼苗 类囊体膜进行了分析，结果显示:(1)野生型和突变体生长10天的子叶和60天 的真叶类囊体膜色素具有类似的室温吸收光谱，但前者的吸收峰值要高。突变体 chla的680一690nm的红光区吸收峰和440-450nm蓝光区吸收峰都较野生型低且 有所红移。突变体680-660nm和490-500nm的Chlb吸收峰非常弱，但真叶又 较子叶的吸收峰值高;(2)叶绿素荧光分析表明突变体类囊体PSII反应中心的 436nm和475nm激发的685nm荧光发射强度子叶中降低，真叶中反而增强;(3) 类囊体膜的温和电泳结果显示，突变体中捕光色素蛋白复合物含量减少，核心天 线CP47的含量明显减少，而CP43的含量却略有增加。DCIP光化学还原活性明显 降低:(4)突变体和野生型油菜类囊体膜蛋白LHCII组成并未发生改变，与LHC II构象有关的685nm处的CD信号在野生型和突变体中均发生了红移。表明: 突变体中LHCII组成没有变化，色素缺乏却影响了LHC工工的含量。同时核心天线 与色素的结合也发生了变化。 第四，突变体与野生型油菜不同生长时期幼苗不同器官多聚核糖体的分析发 现，在突变体中多聚核糖体结合mRNA的能力略有降低，说明mRNA翻译成蛋白质 的效率略有减弱。 关键词 油菜 黄化突变体 Toc33/34 叶绿体发育 LHCII多聚核糖体 StudyOntheDevelopmentalCharactersofChloroplastsina YellowTypeMutantofOilseedRapeSeedlings MajorBioch