一种利用尿液对尿路上皮细胞癌进行诊断的多位点多色荧光原.docVIP

一种利用尿液对尿路上皮细胞肿瘤进行诊断的多位点多色荧光原位杂交试剂盒的研发 Journal of Molecular Diagnostics, vol. 2, No. 3, August 2000 【摘要】本研究的目的即为研发一种多位点多色荧光原位杂交试剂盒，可用于检测尿路上皮细胞肿瘤（UC, Urothelial Carcinoma），使用检测样本为尿液样本。对21例尿路上皮细胞肿瘤患者和9种正常捐献者尿液中的脱落细胞进行检测，使用的探针包括9种染色体计数探针和1种位点特异性探针，目的为确定一种最优的FISH探针组合方式。最后确定四种探针的组合可以达到最高的灵敏性，这些探针分别用不同的荧光物质进行标记，组合对泌尿上皮细胞癌进行检测。这四种探针为CEP 3，CEP 7，CEP 17和LSI p16，组合敏感性可达最高。随后，该探针组被前瞻性地用于179例病人尿液样本，用于尿路上皮细胞癌的检测(其中46人有活检记实的尿路上皮细胞癌)。检测是描述FISH结果玻片，寻找具有恶性肿瘤核特征的细胞，记录这些细胞中FISH信号模式，找出多体(有额外的两种或两种以上不同染色体的)细胞。通过ROC曲线分析可知，如果选取5个多体细胞作为肿瘤阈值，超过5个多体细胞即判读为阳性的标准，可以达到84.2%的敏感性和91.8%的特异性。该研究证实了多位点多色荧光原位杂交检测(包含3，7，17号染色体着丝粒探针和9p21的位点特异性探针)患者尿液样本，可达到很高的灵敏性和特异性。 起源于尿路粘膜(覆盖着膀胱，输尿管和肾盂)的肿瘤被称为尿路上皮细胞肿瘤，是膀胱和上尿路(即输尿管和肾盂)的最常见类型的恶性肿瘤。大部分的尿路上皮细胞肿瘤发生于膀胱，发生于肾盂和输尿管的只占约5%左右1。在膀胱癌中，乳头状非浸润癌，原位癌和浸润深度不超过固有层的称为浅表性膀胱癌。浸润至肌层的称为肌层浸润性膀胱癌。患有肌层浸润性膀胱癌的患者，常常要接受膀胱切除手术以避免发生膀胱癌转移。与之不同的是，患有浅表性膀胱癌的患者，要接受定期(一般为三个月)随访，以避免膀胱癌的复发和进展，随访的手段一般采用膀胱镜和细胞学。无数的研究已经证明了，细胞学有相当高的特异性，但检测膀胱癌时，敏感性相当差2-11。除了细胞学以外，流式细胞也被广泛地用于膀胱癌的检测。然而，急需高灵敏性的检测方法对表浅性膀胱癌患者的复发进行监测测，因为假阴性很可能使患者有向肌层浸润性肿瘤发展的危险。 膀胱癌发生过程中所伴随的遗传学事件正逐渐被人们所了解12-14。P16基因的纯合性缺失是膀胱癌中最常见的遗传学改变之一，发生在膀胱癌形成的早期(对乳头状膀胱癌和原位癌均是如此)15-21。而膀胱癌进展常常伴随着染色体不稳定性及非整倍性的增加12, 22-25。细胞遗传学证实了常见的染色体改变，包括9，17，7， 1号染色体的改变12。这些改变可由FISH技术检测26-32。FISH技术利用荧光标记的DNA探针，针对着丝粒或特异性位点，可以检测染色体数目或结构上的异常。 之前的研究者们已经证明，可以使用尿液或膀胱冲洗液来检测膀胱肿瘤26-32。然而，尽管这一应用明显非常有前景，到目前为止还没有将之用于临床上对膀胱肿瘤进行检测。临床引入迟缓的原因可能包括以下： 以前的FISH实验一般都使用单一探针，限制了检测的敏感度和特异性。 目前检测膀胱癌的FISH实验费时太长，不可能应用于临床。 本研究的目的即为开发一种可以利用尿液对尿路上皮细胞肿瘤的FISH试剂盒，在临床上对浅表膀胱肿瘤术后监测，或者更进一步，对高危人群(如吸烟者)进行筛查。通过实验的结果，我们确定了(1)试剂盒中应该包含哪些探针以达到最优敏感性；(2)前瞻性用于膀胱肿瘤检测的敏感性和特异性；(3)扫描结果玻片，找出恶性细胞的方法；(4)膀胱肿瘤阳性的诊断标准。 【材料与方法】 病人 对21例尿路上皮细胞肿瘤患者和9种正常捐献者尿液中的脱落细胞进行检测，目的为找出一个最优的FISH探针组合。最优的FISH探针组合确定后，再前瞻性地用于检测179例病人，其中93例有膀胱肿瘤病史，86例无膀胱肿瘤病史。这86例无膀胱肿瘤病史的病人，有一系列泌尿生殖道症状和体征，包括梗阻性或激惹症状。用于FISH检测的179例病人尿液样本取自膀胱镜之前，随后立即行膀胱镜检查。 尿液处理 用于FISH检测的尿液样本在24小时之内处理。1200×g，8分钟离心细胞。沉淀用15毫升低渗溶液(0.75 mol/L KCL)重悬10分钟。再1200×g，8分钟离心细胞。以甲醇：冰醋酸3：1溶液10毫升重悬固定。这一步骤重复两次。最终的细胞沉淀(取决于细胞沉淀的大小)用剩余的甲醇：冰醋酸重悬定容至50～200微升， 玻片制备 在本研究的探针选择部分，玻片制备时，用巴氏滴管将一部分细胞悬液滴在标准玻片上，用