反义4CL与UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析.pdfVIP

植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 459464, .实验简报. 反义4CL 与UGPase 双价基因在烟草中的转化及表达分析 * 梁海泳, 夏秀英 , 高晓蓉, 苏乔 大连理工大学环境与生命学院, 大连 116026 摘要 构建了携带紫穗槐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)基因和4-香豆酸: 辅 酶A连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase, 4CL)反义基因的双价基因植物表达载体, 用热激法转化至根癌农杆菌LBA4404 中, 并用制备的农杆菌工程菌进行了烟草转化。PCR及Southern 杂交结果证实, 双价基因已成功整合到烟草基因组中。综纤 维素和硫酸木质素含量测定结果显示, 转基因烟草纤维素含量增加, 木质素含量减少, 表明双价基因能够有效表达。 关键词 纤维素, 辅酶A 连接酶, 4-香豆酸, 木质素, 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶, 双价基因 梁海泳, 夏秀英, 高晓蓉, 苏乔 (2007). 反义4 CL 与UGPase 双价基因在烟草中的转化及表达分析. 植物学通报 24 , 459464 . 用基因工程技术调控纤维素及木质素的生物合成, 植物木质素及纤维素生物合成、改良植物品质的方法 培育高纤维素和低木质素含量的植物新品种, 对造纸、 创造了条件。 纺织和饲草等原料的生产具有重要意义(魏建华和宋艳 茹, 2002) 。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glu- 1 材料与方法 cose pyrophosphorylase, UGPase)可催化形成尿苷二 磷酸- D- 葡萄糖(urid ine d iphos phate D-g lucose , 1.1 植物材料 UDPG), UDPG可作为葡萄糖基供体参与纤维素的合成 烟草(Nicotiana tabacum)品种NC89, 组培苗由本实验 代谢。Xue 等(1998)的研究表明, 转移细菌UGPase 基 室保存。 因, 可提高转基因烟草中的纤维素含量, 增加其生物量。 4- 香豆酸: 辅酶A 连接酶(4-coumarate: coenzyme A 1.2 菌株和质粒 ligase, 4CL)是控制木质素生物合成的关键性限速酶, 主 大肠杆菌DH5、根癌农杆菌LBA4404 由本实验室保 要催化羟基苯乙酸到相应的硫脂的反应, 可利用不同的 存; 质粒 pBU 和pBa4 C L 分别含有来源于紫穗槐的 底物(香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸等)来调节木 UGPase 基因和4CL 反义基因, 由本实验室构建。 质素合成。已有研究表明, 抑制4CL 基因表达后, 转基 因植物的木质素含量普遍下降, 但转基因植物的生长、 1.3 酶和试剂 发育及形态结构基本不受影响(Wei et al., 2005)。可见4CL SacI、EcoRI 和BamHI 酶均购自宝生物(大连)有限公 基因是理想的改良植物品质的目标基因。 司; DNA 片段回收试剂盒购自北京鼎国生物工程公司; 本研究将来源于紫穗槐的UGPase 基因和4CL 反 Southern 杂交试剂盒(DIG High Prime Labeling and 义基因共同连接到质粒载体pBI121上, 构建双价基因植 Detection Starter Kit II)购自Roche 生物公司。 物表达载体; 采用根癌农杆菌介导法, 将双价基因转移至 烟草基因组中, 获得大量转基因植株, 为研究双价基因对 1.4 双价基因植物表达载体构建 转基因植株纤维素及木质素合成的影响, 探索有效调控 首先用引物F 1: 5 A T G C GA G CT C GA T C GT T C- 收稿日期: 2006-07-04 ; 接受日期: 2007-0