第 9 讲 DNA RNA 蛋白质操作技术(2).pdfVIP

第九讲第九讲 分子生物学研究法分子生物学研究法 --DNA、RNA及蛋白质操作技术（2 ） 刘志鹏刘志鹏 内内容容 5.1 重组DNA技术回顾 55.22 DNADNA 基本操作技术基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 55.44 SNPSNP 的理论与应用的理论与应用 5.5 基因克隆技术 55.66 蛋白质组与蛋白质组学技术蛋白质组与蛋白质组学技术 5.3 RNA基本本操作技术 1. 总RNA的提取 22. mRNARNA的纯化的纯化 3. cDNA的合成 4. cDNA文库的构建 55. 基因文库的筛选基因文库的筛选 注意事项 由于由于RNARNA酶酶存在于所有的生物中并且能存在于所有的生物中并且能 够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，，固此建立固此建立 一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很 重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤 其重要其重要。 RNA的完整性 rRNA大小完整，而且28S rRNA和18S rRNA亮 度接近度接近22：11；mRNARNA分布均匀分布均匀，则认为则认为RNARNA质量较质量较 好。 评价：亮度、弥散、锐度 mRNA纯化 使用Oligo dT Primer时的cDNA合成 缺陷：不具有ploy （A ）尾结构的mRNA无法使用此方法！ 1、原核生物: 蓝藻，念珠藻，颤藻，色 球藻球藻 ，，念球藻念球藻。。 2、真核生物: 团藻，衣藻，黑藻，绿藻 ，褐藻等褐藻等。 使用Random Primer时的cDNA合成 缺陷缺陷：cDNAcDNA的合成可以从的合成可以从mRNAmRNA模板的许多位点同时发生模板的许多位点同时发生， 而不仅仅从3´-末端的oligo(dT)引物一处开始。3’可能不完整！ 定向cDNA合成及分子修饰的注意事项： mRNAmRNA反转录成反转录成cDNAcDNA可同时在反转录系统中可同时在反转录系统中 加入Oligo （dT ）12-18-mer及随机引物RP， 以保证得到全长cDNA； 选用活性较高的选用活性较高的反转录酶反转录酶； 合成的合成的cDNAcDNA的方向性的方向性及及甲基化甲基化dCTPsdCTPs 的选用的选用。。 cDNADNA文库的构建文库的构建 cDNA文库的载体选择要根据该文库的用途来确 定，例如常用的Uni-zap XR载体是一种λ噬菌粒载 体体，，具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝 白斑筛选的便利，可容纳10kb DNA插入片段。 以λ噬菌体构建cDNA文库的流程图 • 体外包装反应的实验室条件要求非常精确 ，DNA和蛋蛋白提取物取物的浓度度、两者者的体积体积 比、反应温度及时间对包装效果都有很大 影响影响，而包装结果的好坏对重组噬菌体的而包装结果的好坏对重组噬菌体的 侵染力有重要的影响。 PCR筛选法筛选法 前提：已知足够的序列信息并获得基因特异性 引物引物。具有操作简单具有操作简单、快捷等特点快捷等特点。 菌落PCR筛选法 文库PCR筛选法 免疫筛选法 1.该种方法适用 于表达文库的于表达文库的 筛选。 2.必须有针对基 因产物的特异 性抗体性抗体，才能才能 用免疫学方法 筛选筛选。。 55.44 SNPSNP的理论与应用的理论与应用 5.5 基因克隆技术 图1 水稻籽粒发育特征 AA ，，籽粒在每个时间点籽粒在每个时间点(day(day afterafter floweringflowering，，DAF)DAF)干鲜重干鲜重 （（毫克毫克//粒粒））的动态变化的动态变化。。图中标准误来自三次重复测量的结果图中标准误来自三次重复测量的结果，，每个时间点收集每个时间点收集100100粒左粒左 右的未成熟籽粒用于统计；B，籽粒发育期间各个时期的代表性外观图；C，发育籽粒的纵