几种常见DNA、RNA含量测定方法应用.pptxVIP

DNA、RNA含量的测定方法一、DNA含量的测定方法1.光密度测定法一、DNA含量的测定方法实验原理嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，在230nm处为吸收低谷，其吸光率以A260表示，A260是核酸的重要性质，对于纯的核酸溶液，测定A260即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1μg/ml的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。据朗波－比尔光吸收定律A＝-lgT＝εbc知，c＝A/εb，而b通常为1cm，所以，通常以1OD值相当于50μg/ml双螺旋DNA。一、DNA含量的测定方法1.光密度测定法实验仪器分光光度计一、DNA含量的测定方法1.光密度测定法实验方法(1)取5ulDNA样品或4ulRNA样品加水到1ml(2)用1ml水做空白(3)把样品杯放在分光光度计比色槽上，测定A260(4)每ml中DNA浓度(mg)将是OD值的10倍，例如稀释后样品在260nm处OD值为0.2，则原DNA或RNA样品浓度为2ug/ml（注：若样品不能达到绝对纯度也可以通过绘制标准曲线来计算样品DNA浓度）一、DNA含量的测定方法1.光密度测定法应用范围仅限于对于提取的DNA几乎不含有其它杂质且浓度大于0.25ul/ml的情况下适用一、DNA含量的测定方法1.光密度测定法优点：操作简单方便快速适用性广，精确性高缺点：对DNA样品的浓度和纯度有较大要求一、DNA含量的测定方法1.光密度测定法2.琼脂糖电泳凝胶检测法一、DNA含量的测定方法实验原理DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量、电荷量、分子大小及构象有关。因此通过电泳可大致将分子量不同的DNA分离开。之后通过在凝胶中加入少量EB（其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下呈现荧光）来对DNA进行检测和分析。而相同分子量DNA浓度与其荧光亮度呈正比。因此DNA片段的浓度可与已知浓度的DNA同时进行电泳，通过结合的EB荧光强度，来估计其含量。一、DNA含量的测定方法2.琼脂糖电泳凝胶检测法实验仪器微波炉一、DNA含量的测定方法2.琼脂糖电泳凝胶检测法实验仪器凝胶电泳槽一、DNA含量的测定方法2.琼脂糖电泳凝胶检测法实验仪器凝胶成像系统一、DNA含量的测定方法2.琼脂糖电泳凝胶检测法实验方法（1）制备琼脂糖溶液（2）将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，放上梳子，梳子须离开电泳 支架底部1mm左右。待凝胶凝聚后，小心拔去梳子，将支架放入 装有电极缓冲液的电泳槽中，电极缓冲液应淹没过胶（3）电泳：取琼脂糖凝胶，滴加加样缓冲液3ul和DNA样品20ul，混匀，用移液枪加入样品槽中。点样端朝负极，通电。电压为10v/cm。至溴酚蓝移到距边1cm处，取出凝胶，紫外灯下检测（4）检测：通过与已知浓度相同分子量Marker亮度的对比大致读出目标DNA的浓度一、DNA含量的测定方法2.琼脂糖电泳凝胶检测法应用范围通过灵活使用琼脂糖凝胶浓度和Marker几乎所有的DNA样品浓度都可以被测定一、DNA含量的测定方法2.琼脂糖电泳凝胶检测法优点：操作简单方便快速适用性广，可以对不同分子量DNA的混合样品进行一次性检测缺点：不能精确测量出DNA的浓度一、DNA含量的测定方法2.琼脂糖电泳凝胶检测法3.二苯胺法一、DNA含量的测定方法实验原理在酸性溶液中，DNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，该物质在595nm有最大吸收，在40～400mg/mL范围内其峰值与DNA含量成正比。 100℃DNA +蓝色物质冰醋酸，少量硫酸一、DNA含量的测定方法3.二苯胺法实验仪器分光光度计一、DNA含量的测定方法3.二苯胺法实验方法（1）制作标准曲线：取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。试管012345标准DNA/mL00.40.81.21.62.0蒸馏水/mL21.61.20.80.40二苯胺试剂/m恒温水浴中保温1h，冷却，在595nm波长处比色光密度值一、DNA含量的测定方法3.二苯胺法实验方法（2）测量及计算：取待测样品2mL，加入二苯胺溶液4mL，摇匀，60℃保温1h，然后在595nm波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的DNA的