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纳米信标生物传感器在海洋微生物检测与分析中基础研究 目录 微生物腐蚀 二、研究现状 三、研究结果 实验仪器 酶标仪 紫外分光光度计 测定显色反应光度值的变化 氧化锰纳米材料合成 酶促反应动力学 固定MnO2量，通过分别改变TMB的量来计算Km，Vmax， kcat。 酶促反应动力学 p H、温度和H2O2浓度对于材料和酶催化活性的影响 材料和酶的稳定性 基于不同聚合物修饰抗体 两种标记方法来分析微生物 本工作研究了氧化锰纳米线作为信号标记物来检测微生物，相对于HRP酶来说，氧化锰材料具有更好的稳定性，并且更加廉价。 感谢 各位老师和同学的批评指正! * 二、研究现状 一、研究背景 三、研究结果 硫酸盐还原菌是中在能够将硫酸根离子转换成硫离子的厌氧型微生物。 其产生的代谢产物，特别是硫离子具有很强的腐蚀性，毒害性和反应性 一、研究背景 M. Labrenz et al. Science 290 (2000) 1744. SRB G. Muyzer et al. Nat. Rev. Microbiol. 6 (2008) 441. 硫酸盐还原菌的快速检测对于海洋环境和微生物腐蚀与防护具有重要意义。 硫酸盐还原菌的检测方法 2.1 生物传感器在微生物检测中应用 2.2 传统的检测方法 培养法 基于特征化合物检测方法 基于遗传标记的检测方法 基于细胞的检测方法 1、最大可能数法 2、琼脂深层培养法 3、溶化琼脂管法 1、硫离子选择电极法 2、三磷酸腺苷法 3、三碘化甲基蓝法 4、硫酐还原酶法 5、放射性呼吸测定 1、聚合酶链反应 2、荧光原位杂交 3、限制性片段长度 多态性 1、酶链免疫吸附检测 2、凝集反应 3、荧光抗体技术 硫酸盐还原菌的检测方法 2.1 匡飞 博士论文《硫酸盐还原菌对海洋腐蚀行为的影响》中国科学院海洋研究所，2008 氧化锰纳米材料作为信号标记来分析和检测微生物 比较两种不同的ELISA反应 HRP标记的ELISA MnO2标记的ELISA 3.1 氧化锰介导的免疫反应 TMBre+H2O2→TMBox+H2O TMBre OD 值 652 nm （酶促动力学） OD 值 450 nm （微生物分析和检测） （a）氧化锰纳米片基于通过在TMA的作用下二价锰与双氧水室温条件下获得。 （b）通过高锰酸钾和硫酸锰在室温下反应制备 （c-e）通过高锰酸钾和硫酸锰在160oC在反应釜中分别反应0.5，8 以及72h制备 张熊， 《二氧化锰及其纳米复合材料的可控制备与性能研究》北京化工大学博士毕业论文 2008 （A）纳米片、纳米球、纳米线、纳米混合物以及纳米棒五种材料随着TMB浓度增加的反应速率的变化，呈现米氏动力学的变化趋势。 （B）对纵轴和横轴求倒数，得到的直线方程便于获得动力学中的最大反应速率（Vmax）和Km 酶促反应动力学 研究不同氧化锰纳米材料的酶促动力学，发现纳米线的催化效率最高，稳定性最好 氧化锰纳米线和HRP酶的催化活性随着pH（A）、温度（B）和过氧化氢浓度（C）的变化 对于氧化锰来说，p H为5.1、温度为50 oC，在没有过氧化氢条件下的催化活性最大。 对于HRP酶来说p H为3、温度为40 oC，过氧化氢条件浓度为10 mM的催化活性最大。 （A）pH对于材料和酶稳定性的影响。 （B）温度对于材料和酶稳定性的影响。 氧化锰纳米线：最适应的存放p H 为pH5.0，而温度的存放对其活性影响不大。 HRP酶：最是存放温度低于40 oC，最适pH为5-7 有机聚合物 活化剂 抗体 MnO2 纳米线 右旋糖苷（-OH） 海藻酸（-COOH） 壳聚糖 （-NH2） 不添加任何有机聚合物 物理吸附 (a) 戊二醛 (d) EDC/NHS (c) NaIO4 (b) （A）基于四种不同材料的抗体修饰后的纳米材料活性。 （B）基于四种不同材料抗体修饰后的定性分析抗体修饰的量 最终选择右旋糖甘作为下一步实验的抗体修饰和交联的聚合物 Log NSRB (CFU) Absorbance (450 nm) HRP-ELISA Absorbance (450 nm) Log NSRB (CFU) MnO2-ELISA 采用HRP和氧化锰纳米线标记技术来检测SRB：对于HRP标记的免疫反应来说，其检测线1.8×105—1.8×108 cfu mL-1之间,检测限为1.8×105 cfu mL-1;对于氧化锰纳米线标记的免疫反应来说，其检测线1.8×104—1.8×107 cfu mL-1之间,检测限为1.8×104 cfu mL-1 3.2 本部分小结 *