转基因动物的遗传修饰与应用(上).pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)17(2):42-481995 转 基 因 动 物 的遗 传 修 饰 与 应 用 （上）① 程炜中 刘应伯② 余其兴 武（汉大学生命科学学院遗传学系，武汉430072) TheGeneticModificationandApplicationofTransgenicAnimals（I） ChengWeizhong LiuYingbo YuQixing 归epartmentofGenetics,SchoolofLifeSciences,WuhanUniversity,Wuhan43007乃 首例转基因超级小鼠问世十多年来，以转生长激素基因为突破口的转基因动物研究在世界范围内已取得了一 系列重大进展，并由技术上的成功开始转向复杂的生物试验体系的研究，以及从理论一应用诸不同角度出发探索不 同的生物学重大问题。纵观国内外转基因动物研究动态，可以看到这一基因工程新技术正在经历着许多方面的重 大变革，也相继产生了许多新的问题，并正在引起科学家们的高度重视。本文仅就其中几个重大间题予以讨论。 1．转基因动物的实验方法 外源基因向动物细胞的转移方法，依所用目的基因的性质、受体动物及其受体细胞和转移目的之不同而异，概 括起来主要有以下几种： 1.1DNA显微注射法 这是目前世界上广泛使用、效果较好的一种基因转移方法，就是把外源基因通过显微操作仪注射入受体动物 受精卵细胞中．大体过程是在显微镜下借助于显微操作仪，把毛细玻璃管针直（径0.5-1.印m）直接插人受精卵前 核中注人外源DNA哟2plt细呱，并以前核膨诱长作为异源基因被准晚导人的形态依据，或庵外V,DNA洛a中加 人适量无毒染料作为导入标记．注射后的受精卵经适当的体外培养，再植人同步发情的受体动物输卵管中，或待体 外培养的受精卵发育至囊胚后再植人受体动物子宫内，以保证转基因胚胎继续正常生长发育，直至分娩产出。 然而，鱼类等水生动物大多是体外排卵受精，产卵量很大 随（鱼类种属和环境条件不同，一次产卵可达几百个， 甚至几百万个），所以很容易获得转基因受体细胞。我们实验室一般采用鱼用性激素和垂体提取液混合注射法对亲 代鱼人工催产，分别收集卵子和精液，体外人工授精3-5min后，用胰蛋白酶消化去除卵壳，再将线性化外源DNA 显微注人第一次卵裂前的受精卵中，室温下约（25r-）培养至心跳期，然后转人水中进行正常的胚胎发育．但是，对 于卵壳较硬的冷水性蛙缚鱼类来说，蛋白酶消化无法去除卵壳，一般用三种变通的显微注射法，如MP法，即从受 精孔将外源DNA注人受精卵中；El法，即在卵刚受精后卵壳尚未变硬时直接注人；以及LI法，即先用硬金属针在 卵壳上打一个孔，再注人DNA. 目前，虽然利用受精卵进行DNA显微注射研究在许多动物中已获很大成功，但仍存在着外源基因在受体细胞 中整合率不稳定等弊端，如小鼠受精卵中转基因整合率整（合基因的幼仔数 ／移植或培养的胚胎数）为6-40%,猪 和羊分别为0.98％和0.1．而鱼类通常可达 10-75%．与此同时，也有人用体外培养的成熟卵进行DNA显微注 ①本文是在余先觉教授的悉心指导下完成的，在此表示诚挚的感谢和敬意。 ②现工作单位：武汉市职工医学院，430016. 2期 程炜中等：转基因动物的遗传修饰与应用 上（） 43 射研究，已成功地将鸡6-晶体蛋白基因转移入青细卵母细胞核，手术后卵子受精率达70％左右，外源基因的整合 率也较高。也有人采用类似方法将抗冻蛋白A(（FP)基因导人金鱼卵母细胞，手术后卵子受精率达74.8 ，外源基因 的整合率达18.6 ．但卵母细胞培养要求条件较为苛刻，因此极大地限制着这一方法的使用． 1.2电脉冲法 这是一种操作比较简便、处理批量较大的基因转移方法，但转移效率较低．方法是将受精卵与外源DNA按 一定比例混合后，放人一电脉冲槽中，在一定强度的脉冲电压下，外源DNA即可进入受精卵．这种方法已在鱼类 等水生动物基因转移中取得成功，整合率为4％或 10％左右．其作用机理尚不清楚，可能是在脉冲电场作用下，受 精卵膜表面带电量及电荷性质的变化引起膜分子构型改变，外源DNA分子乘机导人之故。 1.3精子介导法 这是一种简单易行、直接用精子作为外源DNA载体的基因转移方法