转座子TnS-Mob对菜豆根瘤菌共生基因的诱变、转移和初步定位1).pdfVIP

遗 传 学 报， 15(2):102--110,1988 ActaGenetics Sinica 具有原核基因启动子．活性的蓖麻蚕 染色体DNA片段 刘小明 沈绿萍 李载平 （中国科学院上海生物化学研究所） 利用大肠杆菌启动子克隆载体 pHE5,研究了蓖麻蚕染色体的Hind川酶解片段在大肠 杆菌中作为四环素抗性基因启动子的功能作用。蓖麻蚕染色体的Hind川 片段与pHE5重 组，在大约10“个重组子中获得953株启动子重组体。 测定了这些含有重组质粒的菌株伉四 环素能力，其中有4株在平板上抗四环素水平超过225微克／毫升。对其中pARP201的插入 片段进行了限制性图谱分析和启动子活性区域的缺失定位，证明了pARP-DB （由pARP201 衍生而来）中的约0.5kb的外源插入片段具有完整的原核启动子功能。我们分析了这段DNA 的部分核昔酸顺序，发现它与原核基因启动子极其相似。 关键词：蓖麻蚕染色体，大肠杆菌启动子克隆载休，四环素抗药性，DNA顺序 在基因工程操作中，要使目的基因高效表达，启动子的选择和使用极为重要。 为 了广泛地收集高效启动子，弄清它们的结构与功能关系，专门构建了许多启动子克隆载 体20〔,3,71。这些载体质粒上虽然具有抗四环素基因的编码顺序，但由于启动子已经被切除， 整个基因不能表达，其宿主菌在四环素培养基上不能成活。若在 四环素抗性基因之前插 人新的启动子，可以使四环素抗性得到恢复，以此可以对各种启动子进行筛选。已有的报 道指出，这样的启动子克隆载体不仅能探查原核染色体中的启动子11〔，而且发现在某些真 核生物的染色体 DNA 中，存在着一些具有原核启动子功能的 DNA片段2,〔6,1a,1310 我们利用大肠杆菌启动子克隆载体pHE512o1，克隆并分离出许多蓖麻蚕染色体DNA 的HindIII片段，它们具有原核基因的启动子活性。 通过抗四环索能力测定、活性片段 的缺失定位及其 DNA核营酸序列分析，证明我们所克隆到的活性片段具有原核基因启 动子的典型结构和高效的活力。本文的结果有助于加深我们对原核启动子与真核启动子 相互关系的认识，指出了这一筛选模型对于获得高效启动子的有效性，对这一工作的理论 意义和应用前景进行了讨论。 材 料 与 方 法 一（）质粒 DNA、染色体DNA的制备 质粒DNA`d1和大肠杆菌染色体DNA 的制备均按文献报道的方法进行。制备大分子量的蓖麻蚕染色体 DNA参考 Reeder1171 的方法。 本文于1986年12月1！日收到，1987年斗月10日修回。 z期 刘小明等：具有原核基因启动子活性的蓖麻蚕染色体 DNA片段 二（）酶制剂及其作用条件、大肠杆菌转化按文献[9)}琼脂糖凝胶电泳和缺口翻译按 文献[11]方法进行。 DNA墨迹转移杂交按文献[191进行。 限制性内切酶和 T4DNA连接酶由我组工具酶小组提供。蛋白酶K和碱性磷酸醋 酶为 BRL公司产品，RNaseA和DNaseI为东风生化试剂厂产品，DNA聚合酶和多 核昔酸激酶为中科院生物物理所制品。同位素试剂 [a-32pIdATP,[a-32P]dCTP和 卜一却〕ATP均为AMERSHAM产品。酶反应的条件采用BRL公司推荐条件进行。其 它操作条件见参考文献。 三（）不同菌株抗四环素能力的测定 将含四环素25微克／毫升的LB平板上生 长出的抗性转化子，用牙签分别接种到一系列四环素浓度更高的平板上，370C培养2‘小 时，观察有无菌落生成。重组子恰能生长的平板上四环素的浓度就是固体培养基中的杭 四环素上限。用液体培养的测定方法是将含有不同质粒的过夜培养菌液，以0.5呢接种 量接入含不同浓度四环素的 LB培养基中，四环素浓度为0-100微克／毫升，370C振荡 培养5小时，在波长600nm处光吸收的强弱表示细胞的生长情况。 （四）DNA核昔酸顺序分析 质粒 pARP-DB用 （1)PsiI作用或 2（)HindIII 作用，磷酸酶脱去5’一磷酸基团，用T4多核昔酸激酶以 r〔-PIATP标记 DNA的，－‘ 末端，再用 BglII作用，电泳展开并回收约0.5kb的标记片段，按Max