中国人线粒体DNA的八种限制酶图及其电镜结构.pdfVIP

遗传 学报，15(3):215222,1988 滩CtaGeneticaSinica 中国人线粒体DNA的八种限制 酶图及其电镜结构 贺林 穆金 严 明 王世浚 南（京铁道医学院生物教研室） 尽管Anderson等人 （1981）已测定了人rntDNA的全部序列，但还不能全面地反映整个 人类 mtDNA核昔酸序列的情况。因此，在具有代表特征的中国人mtDNA序列被测定之前， 为了开展对中国人 mtDNA的遗传学研究，笔者构建了中国人 ‘DNA的8种限制酶图。并 通过电镜技术对 mtDNA进行了研究，发现了一种周长为211m的小环状 DNA，推测它可能在 核DNA和 intDNA之间的信息传递或衰老发生中起到某些作用。 关键词：线粒体 DNA，限制酶，电镜结构 自从 1963年 Nass通过电镜证实了线粒体 DNA (mtDNA）的存在后10〔,11)，它作 为一种结构相对简单的真核生物基因组，引起人们的极大兴趣。研究发现t151，mtDNA除 了具有在组织结构上进化高度保守的特征外，还有核昔酸序列突变率高的特点，即在不同 的地理环境下，其核昔酸序列发生较高的歧异 d（iversity)。所以，要想获得对整个人类 mtDNA比较全面的认识，必须开展对不同环境下的各种族 mtDNA的广泛研究。然而， 迄今还未见到有关对中国人 mtDNA 系统研究的报道。因此，笔者从进一步对中国人 mtDNA进行遗传学研究出发，建立了8种限制酶 (BamHI,EcoRT,XhoI,Xha1,Pst1, Kpn1,HindIII,PvuII）图。此外，在电镜研究中，除了观察到国外资料报道的几种mmt DNA形态外，还意外地发现了一种小环状 DNAO 材 料 与 方 法 一（）材料 实验所用材料都取自本土的中国人 汉（族），大多来自正常分娩的胎盘组织。 二（）方法 1．纯化与鉴别mtDNA 根据笔者特地为此项研究建立起的简易法飞【 2.酶解与电泳 为了避开同位素标记等步骤，实验中采用的8种限制酶均为识别1 6个碱基序列的酶。酶解条件随不同要求略有区别：单酶完全酶解，反应总体积为20川， 内含mtDNA1lzg,酶量3-4单位，反应时间1-3小时。单酶部分酶解仅将时间缩短。 为25分钟，其它条件与完全酶解相同。双酶酶解则是将两种限制酶同时加入，反应时间， 为，小时，其它条件同单酶完全酶解。酶解反应均在37℃进行，酶解结束后，放人67QC 水浴5分钟以终止反应。然后立即冰浴。 本文于1986年9月i8日收到。 216 遗 传 学 报 15卷 用无桥水平板型凝胶电泳装置和Agarose凝胶，胶浓度为0.8肠，内含0.知g/ml漠 化乙锭。电压为1.5V/CM，室温下电泳一般为10小时左右。 3，限制酶解片段分子量的测定 以 ,DNA+HindIII和SPP1十EcoRI作为分 子量标准，按照各片段的分子量的对数与其相对迁移率的倒数绘制标准曲线，测定未知片 段的分子量，并参考相应的微机程序11〔0 4。电镜样本的制备 采用甲酸胺法6l〔并略作改进。上相液总体积100川，其成份为： 1upg/mlmtDNA,0.1mgfml细胞色素C,0.1MTris·HC1(pH8.0),0.01MEDTA和 40外甲酚胺。下相液100pi，其成份为：0.01M Tris·HCl(pH8.0),0.001MEDTA, 10务 甲酚胺。mtDNA展开在室温下进行。用覆盖有塑料膜的铜网蘸上mtDNA样品后， 滤纸吸去铜网上多余液体，95%乙醇脱水20分钟，5X10-4M 醋酸双氧铀染色30秒钟， 再用无水乙醇脱水10秒钟。用铂金在 HITACHIHUS-5GB型投影仪中静止投影。用 HITACHIH-600电镜观察、摄影。 mtDNA分子周长的测定是通过用棉线量出照片中mtDNA周长，再根据电镜摄影 和照片放大时放大倍数的总和换算出实际 mtDNA的周长。 5．仪器与试剂 除高速冷冻离心机 （日本精2）和