番茄花柄脱落区多聚半乳糖醛酸酶提取与纯化.pdfVIP

番茄花柄脱落区多聚半乳糖醛酸酶的提取与纯化1 徐杨，齐明芳，李天来，许涛 沈阳农业大学园艺学院，辽宁省设施园艺重点实验室，沈阳 (110161) E-mail：qimf@ 摘 要：多聚半乳糖醛酸酶是植物器官脱落过程中的重要水解酶，本实验以20µL•L-1 乙烯 处理的离体番茄花柄为试材，建立了与脱落相关的多聚半乳糖醛酸酶提取与纯化体系：以 50mmol•L-1 乙酸缓冲液(pH=5.5)为提取液，加入0.1mol•L-1NaCl ，1mmol•L-1DTT 提取效果 较好；将酶的粗提液低温浓缩后，经Sephadex G-75 凝胶层析分离纯化，最佳条件为流速为 0.2mL•min-1 、上样量为3.5mL；再将凝胶层析分离的活性部分低温浓缩后，经CM Sepharose CL-6B 离子交换层析再次纯化，流速0.3mL•min-1、洗脱液pH 值为 5.5 纯化效果好。结果 表明Sephadex G-75 凝胶过滤层析和CM Sepharose CL-6B 离子交换层析是分离纯化番茄花 柄中PG 的一种有效的方法。本实验为研究脱落相关酶的性质及活性调控提供了参考。 关键词：番茄；脱落；多聚半乳糖醛酸酶 中图分类号：Q556+.2；S62 1. 引言 器官脱落是植物界普遍发生的生理现象，是植物长期以来形成的一种对环境适应的能 力，而在农业生产中，如番茄栽培中的落花、落果问题成为影响番茄生产的重要因素。因此， 研究如何调控脱落过程具有重要意义。对于脱落进程调控研究，现已明确生长素抑制脱落， 而乙烯促进脱落，所以在生产中常采用植物生长调节剂来调控脱落，然而，由于植物生长调 节剂施用不当常会造成生理障碍和环境污染等问题。 研究结果表明，细胞壁降解酶系统是导致植物离区细胞发生分离的主要原因，其中多聚 半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase PG ）是植物离区重要水解酶之一，其活性的升高与离区脱 落进程中强度的降低相一致，并且位于细胞发生分离的部位[1-3] 。前人曾对番茄果实和冬枣 果实中的多聚半乳糖醛酸酶进行过提取纯化[4-6]，但其回收率都较低，并且大多研究者关注 的内容多集中在果实软化方面，而在器官脱落与多聚半乳糖醛酸酶的关系方面的研究尚鲜见 报道。本文对番茄离体花柄中脱落相关的多聚半乳糖醛酸酶进行了分离纯化，并在前人的基 础上加以改进，简化了纯化的步骤，提高了回收率，为番茄花柄脱落区多聚半乳糖醛酸酶的 性质与活性调控奠定了基础，进而为从蛋白水平调控番茄花柄脱落进程的研究提供了参考。 2. 材料与方法 2.1 材料 供试番茄（Lycopersicon esculentum L. ）品种为辽园多丽，日光温室栽培。参照王彦昌 等的方法[7]，于番茄开花当天上午采样，剪取各株相同或相近位置花序上正常开放的花，放 入盛在蒸馏水的烧杯中，立即带回实验室，用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗 3 次，剪去花柄 上端花冠，只留花柄部分，插入装有 1％琼脂培养基的培养皿中。并将其放入20µL·L-1 乙烯 培养箱中，于 25 ℃培养。待花柄离区发生分离时，取脱落区上下 1cm 处的花柄作为酶提取 材料，贮藏于-70℃冰箱中备用。 1 本课题得到教育部博士点基金（番茄花柄脱落相关酶—纤维素酶与多聚半乳糖醛酸酶的性质及活性调控 研究（20040157004 ））的资助。 - 1 - 2.2 方法 2.2.1 PG 提取纯化过程 取 1.00g 左右离区组织，加入 5mL 缓冲液进行研磨，12000g，4 ℃离心 20 分钟，取上 清液经低温浓缩后，上样于 Sephadex G-75 凝胶过滤层析柱，柱长 100cm，直径 1.6cm。以 乙酸缓冲液（50mmol/L ）作为洗脱液，洗脱后收集有活性的部分经低温浓缩，经 CM Sepharose CL-6B 离子交换层析再次纯化，柱长 30cm，直径2.6cm 。收集有活性的部分进行PG 活性和 蛋白含量的测定。各处理重复 3 次，数据