一种改进的质粒DIVA提纯方法.pdfVIP

遗传 HERED1CA5(ticijiug) ， （1):-i3.441987 一种改进的质粒DIVA提纯方法，,2) 刘伟民 杨志兴 （黑龙江省科学院应用微生物研究所，哈尔澳) 泣扮 （由关国组约州立大学获得）。 6小时，收集沉淀物，溶于 图1粗提和纯化后 方法 取环‘纯化后的单菌落接种于TE溶液中，即得纯化的质}}`J}!1}省捻f,Ar-q 25ml/250mlLB液体培养基中，37℃振荡培养 粒DNA 图（1-2) (1)Ml是质粒DNA9 BL}oIU5mlA默1菊%)}T-.500ml/2,5O0D0aboiol结果和讨论 DNA（I(1f%7300 达0.6-0.8，加人2.5m1浓度34mg/ml的氯霉 使用上述方法，我们获得了纯化的质粒 素 终（浓度170tzg/ml),370C振荡培养16至20 DNA，经限制性内切酶 BarnHl消化获得I条 小时，以4,000rp。离心30分钟，收集菌体。将 带 ［图2-21。可见木方法纯化质粒DNA可用 菌体悬浮于1Oml溶液1(50mM葡萄糖、lomm 于重组DNAo EDTA,25mMTris-ClpH8.0)中，直接加人 用溶菌酶处A后加入 NaO7I1--SDS可使菌 终浓度5mg/ml的溶菌酶粉剂，温和振荡后室温 体充分裂解，再加入5M醋酸钾后即可沉淀全 放置10分钟，再加人20m1溶液11(0.2NNaOH， 部染色体DNA和菌体碎片。用酚一氯仿除去可 1.0务SDS，用时新配制），温和振荡后冰浴放置 溶性蛋白，粗提物中仍有大量的RNA和少量 15分钟，加人15ml冷的溶液 111(5M醋酸钾 的核酸碎片，用 RNase消化后一再经1GUINaCI pH4.8）冰浴15分钟，20,000rpm离心30分 ．． 一＿ －一－一一— 钟收集上清液，用Tris水饱和酚抽提上清液} Lirti1}e，二，二etal.:、Mo,lifiec3MethodforPlasnzid 次，再以酚一氯仿抽提1次，加人x/10体积的3M DNAIsolation“，，“Purnaofctiii 醋酸钠。H5.2和2倍体积的无水乙醇，一709C ；｝古翼霖禹霎冒琵编鹭暴弄鑫霆鑫芸羚 放置1小时，以15,000rpm离心收集沉淀的贡 本文于q‘86年1月5“收夭J；‘· 牛3 ． 离心，可将全部的 RNA和核酸碎片除去，得 到高纯度的质粒 DNA. 我们认为，只要严格控制反应条件，如操作 时间和温度，就可以获得高纯度的质粒DNA. 纯化后的质拉 DNA经BamHI消化及转化实 验，都证明了用此法提取的质粒 DNA具有生 物学活性。我们从500m1培养液中回收了1.5 mg的质粒DNA，回收率略高于其它方法，可 用于批量制备质粒 DNA. 参 考 文 献 ［1］杨志兴等：1985。遗传，7(5);43-44, 轰21T.Maniat