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金属硫蛋白的研究进展 蔡震峰 任凤莲??????????????(中南大学化学化工学院,湖南长沙　410083) 摘　要:金属硫蛋白(MT)是一类低分子量、高巯基含量,能大量结合重金属离子的蛋白质,因其功能独特,近年来对MT各方面的研究日益受到重视。本文对MT的性质、分类、常用提取方法、分离纯化方法、检测方法以及功能作了逐一综述。重点阐述了MT的检测方法,提出了有待研究解决的问题,展望了其应用前景。关键词:金属硫蛋白;提取;分离纯化;检测中图分类号:Q 51　　　文献标识码:A　　　文章编号: 1671 - 3206 (2007) 02 - 0187 - 04? 1957年，美国科学家Margoshoes和Vallee[1]在研究金属生物学作用时，从动物器官中分离出一种新的蛋白质。由于它是一种低分子量、高巯基含量，能大量结合重金属离子，因此将该物质称为金属硫蛋白（metallothionein，简称MT）。根据现有研究，MT主要分为MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。MT分子呈椭圆形，分两个结构域，分子量为6000～7000道尔顿，直径30～50A，含有61个氨基酸，其中21个氨基酸为半胱氨酸，这样每一个MT分子就可以结合7～12个金属离子。人体、动物、植物以及微生物体内均含有MT，而且其理化特性基本一致，具有特殊的光吸收。MT构象较坚固，具有较强的耐热性。 对于金属硫蛋白的研究，国内外主要集中在提取、检测以及应用上。由于在实际生产中，主要采用层析法，分离纯化后的金属硫蛋白中还含有其它的杂蛋白，因此本文作者正在进行金属硫蛋白的分子印迹聚合物的研究，使其更好地应用于金属硫蛋白的纯化。 1 金属硫蛋白的理化性质 一般来说，哺乳动物的MT分子量为6000～7000道尔顿，但去金属后即硫蛋白分子量为6000道尔顿左右，而真核微生物的MT分子量范围较大，为2000～10000道尔顿，如从粗糙脉孢菌中分离出来的MT分子量为2500道尔顿左右，酵母菌中分离得到的MT分子量为8000～10000道尔顿。高等植物的MT的分子量为10000～13800道尔顿。MT的等电点pI一般在4左右，如哺乳动物MT的等电点在3.9～4.6之间，已发现的水生生物MT的等电点在3.5～6.0之间。使各种金属硫蛋白中50%的金属离子发生解离的pH分别为Zn-MT 3.5～4.5,Cd-MT 2.5～3.5,Cu-MT pH﹤1.0，但对植物中的MT来说，相应的pH要偏高些。MT的存在形式及稳定性与它所结合金属的种类，是否结合了金属及环境的pH密切相关。同样，MT的光吸收特征除了与它的氨基酸组成有关外，也与它所结合的金属种类密切相关[2]。 2 金属硫蛋白的分类及分布 MT的结构在生物进化中高度保守，有四种异构体，MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在，尤以肝、肾细胞为主，而且参加其功能调节。MT-Ⅲ分布主要限于中枢神经系统，主要分布于星性胶质细胞（集中于细胞体和突起中），其次为神经元细胞，也有报道称少量分布于生殖细胞、小肠、胃、肾和嗅觉皮质细胞中。MT-Ⅳ主要分布于皮肤、舌、消化道等器官的角质细胞和复层鳞状上皮细胞中。 3 金属硫蛋白的提取方法 3.1主要试剂 三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）；5，5-二硫二（2-硝基苯甲酸）（简称DTNB）；PBS缓冲溶液。 3.2 动物的处理 参考Onsaka等的方法[3]，给家兔皮下注射ZnSO44次，第1天注射60mg/只（约15mg Zn/kg），第2、4天注射90mg/只，第7天注射120mg/只，第8天处死动物取其内脏。 3.3 MT粗制品的制备 1）称重：将前一夜放-4℃冰箱中解冻的试样拿出来用托盘天平称重，试样重量M，精确到0.1g； 2）搅碎：将试样用剪刀剪成碎片后，用捣碎机捣约30～50s，捣成匀浆； 3）提取：加入相当于试样重量两倍体积的0.02MTris-HCl，用磁力搅拌器搅约半分钟； 4）变性：加入等体积氯仿：乙醇（0.08：1）变性除杂蛋白，搅拌约5分钟； 5）离心：5000rmp、4℃离心25min，弃沉淀，取上清； 6）热变性：75℃热变性3～5min除杂蛋白； 7）过滤：用冰块速冷后用8层纱布过滤，取清液，静置约2h； 8）离心：8000rmp、4℃离心25min，弃沉淀，取上清，得到匀浆液。 9）层析、冻干：对匀浆液进行层析，然后收集富含MT的层析液进行冻干即得MT粗品。 4 金属硫蛋白的纯化方法 所谓纯化，也就是MT粗品（60%～90%）、MT精品（≥90%）以及纯品（≥95%）的形成过程。由报道的资料看，纯化方法大概是一致的，首先是根据MT-1和MT-2所带电荷不同的性质[4]，进行离子交换将MT-1和MT-2分开，然后将收集MT-1和