基因工程复习资料 U版.docVIP

名词解释10*2 是非10*2 选择10*2 简答5*5 论述 1*15 18日14:00-16:00 教2101 基因工程：是指核酸分子经体外加工，将不同来源的基因按照设计组成新的基因组，再把它引入宿主细胞中，使之表达的技术。简单地可以归结为：通过体外基因操作，引起生物遗传性状改变的技术。基因工程应用在植物方面的就称为植物基因工程。 载体：把一个有用的目的基因DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。目前使用的载体主要有四大类：质粒，噬菌体λ、单链噬菌体和粘粒。 质粒的拷贝数：指质粒在复制时与宿主的繁殖相结合，致使每个细胞中只有一个或几个质粒，质粒在细胞中的拷贝数为10~200个。 转化：是指将外源DNA引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 感受态细胞：是指具有吸收裸DNA分子能力的细胞，通常经一系列的处理方式 可使得细胞膜的通透性发生改变，而使细胞成为感受态细胞。 受体细胞：是指转化的对象，接受重组DNA的细胞，通常要求有高转化率，能保持质粒稳定，属某营养缺陷型，具其他选择标记等条件。 基因组文库：是指把某种细胞的整个基因组DNA，按一定长短要求，酶解成若干片段，在与合适的载体分子重组，引入相应细胞，形成一大批含重组DNA分子的细胞克隆群体，该克隆群体即为基因组文库。 cDNA文库：是指以生物体的RNA(通常是mRNA)为模板，经反转录形成cDNA分子，予以克隆形成的一种基因文库。 S-D序列：细菌mRNA翻译起点上游与16SrRNA相结合的序列。 退火：是指PCR等核酸分子重组过程中，即DNA加热变性后逐渐冷却的过程，在分子遗传中，应用于不同来源的核酸分子形成杂合体的研究中。 转化外源基因的稳定表达:是指外源基因整合到核基因组DNA分子上，并能稳定遗传的外源基因的表达。 分子标记:可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白。包括蛋白质标记和DNA标记。 转座子 基因工程的研究内容 1．特定目的基因的分离或合成 2．构建重组DNA分子 3．转化宿主细胞 4．筛选重组DNA菌落 5．目的基因的有效表达 基因工程的基本操作程序主要包括五个方面的内容： 带有目的基因的DNA片段的制备 DNA片段与载体DNA体外重组 DNA重组体转入受体细胞 重组体克隆的筛选与鉴定 外源基因的表达 制备外源DNA片段可以有以下5个途径： 从生物基因组群体中分离目的基因（鸟枪法即限制性内切酶法、反转录法） 人工合成 PCR反应合成DNA mRNA差异显示法获得目的基因 机械的方法如超声波把基因组打成片段。 工具酶：基因工程中进行基因的剪切、拼接、组合所需的酶统称为工具酶 工具酶按功能分为剪切酶、修饰酶、连接酶 限制性内切酶的特点：只降解双链DNA分子，而不切单链DNA，反应时需金属Mg2+离子等。 影响限制性内切酶活性的主要因素： 酶的纯度 DNA样品的纯度 DNA的甲基化程度 酶切反应的温度与时间 DNA分子的构型 反应缓冲液  常用的聚合酶有三种：即依赖DNA的DNA聚合酶；依赖RNA的DNA聚合酶；依赖DNA的RNA聚合酶。 理想的基因工程载体的要求： 1．能在受体细胞中独立繁殖 2．容易导入受体细胞 3．有限制性内切酶位点 4．分子量小，多拷贝易于分离、纯化、导入 5．有容易识别的筛选标记，  载体的种类：质粒、噬菌体、病毒、粘粒 质粒的三种构型：共价闭合环状DNA（cccDNA)、开环DNA（ocDNA)、线形DNA（LDNA) 质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同 电泳顺序(快到慢)1 SC 2L 3 OC 为什么要质粒质粒载体的构建？ 1、天然质粒的局限性 （1）分子量大，拷贝数低 （2）筛选标志不理想 质粒载体必须具备的基本条件 （1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因 （3）若干限制性内切酶的单一位点 （4）具有较小的分子质量和较高的拷贝数  质粒载体是以PBR322为基础进行构建的 pBR322的优点 1）双抗菌素抗性选择标记 没有获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet中都死亡 获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet其中之一中死亡 2）分子小，克隆能力大 载体越小越好，大于10kb的DNA在纯化过程中容易断裂 3）高拷贝数 4）安全 粘粒载体的特点： 1.具有(噬菌体的特性，在寄主细胞内形成环化DNA 2.具有质粒载体的特性，能象质粒一样复制。 3.方便的选择 4.高容量的克隆能力 大分子DNA克隆载体： 一、酵母人工染色体YAC YAC载体的基因结构 着丝粒区（CEN）主管染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子细胞中 端粒（TEL）对于染色体的稳定及端粒复制具有重要意义 复制