狂犬病毒Hep-Flury-dG株的拯救及其生物学特性的研究.pdfVIP

Chinese PublicHealth ·260· Veterinary Association，CAAV 狂犬病毒Hep-Flury-dG株的拯救及其 生物学特性的研究 刘晓慧 艾 军 孙招金 陈 晶 孙京臣 郭霄峰4 (华南农业大学兽医学院微生物教研室，广州市，510642) 7．N．P-M．G-L．5 摘要：本研究在狂犬病毒弱毒株HEP-Flury株全基因组3 7的伪基因区域(G与L之间)，插入一 个G基因，构建了携带双G基因的全长感染性克隆，其与辅助质粒共转染BHK-21细胞，成功获得狂犬病毒ImP．Flury dG嵌合病毒，盲传十代，用荧光抗体和RT-PCR鉴定，该嵌合病毒在BHK-21细胞中稳定生长；并对其进行生物学 型基因工程疫苗奠定了基础。 关键词：狂犬病毒；反向遗传；糖蛋白；狂犬病疫苗 狂犬病是由狂犬病毒引起的一种人畜共患病，病死率几乎高达100％。该病流行于100多个国 家和地区，全世界每年因狂犬病死亡的人数达55000人，印度是狂犬病流行最严重的国家，其死亡 人数占一半；中国的狂犬病例数仅次于印度，占世界第二位。目前，对狂犬病尚无有效的治疗方法， 及时接种疫苗是预防狂犬病的最有效措施之一，因此，疫苗株的选择是狂犬病控制的有效因素之一。 为了研究一种新型的狂犬病弱毒灭活疫苗，国内外学者利用反向遗传操作系统在基因重排和缺 失P基因方面进行了探索和研究。研究发现，基因发生重排的病毒接种小白鼠后，机体的免疫水 平并没有降低。Flanagan等报道，将与狂犬病毒同属于弹状病毒科，基因结构十分相似的水泡 性口膜炎病毒(VSV)的G基因从基因组的第四位重排至离病毒启动子较近的位置，G基因重 的G—L基因问增加一个G基因的开放阅读框，获得携带双G基因的狂犬病毒，其G蛋白表达量为 明显的提高机体抗体的产生。 有鉴于此，本研究以弱毒株Hep—Hury为基础在其基因组G—L基因之间增加一个G基因的开 放阅读框，拯救获得携带双G基因的狂犬病毒Hep．Rury．dG株，并对其进行了生物学特性的研究， 从而为研制高效、安全、具自主知识产权的狂犬病基因工程疫苗奠定了科学基础。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1质粒及毒株 业大学兽医学院微生物教研室通过反向遗传拯救获得，由微生物教研室保存提供。 1．1．2 酶类及其它相关试剂 I和Pst RNA提取试剂Trizol I均购于宝生物 LS购自Invitrogen公司；AMV反转录酶、BsiW 工程(大连)有限公司；RNA酶抑制剂(RibonucleaseInhibitor,Rnasin)购于美津生物工程公司； Plasmid Transfection Kit和SuperfectReagent购自Qiagen公司o 1．1．3细胞和细胞培养相关试剂 ， ． 仓鼠肾(BHK一21)细胞，购自卫生部武汉生物制品研究所；小牛血清，购自广州展辰生物公司； DMEM购自广州英韦创津生物公司； j通讯作者：郭霄峰。020xfguo@scau．exlu．cll 中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第一次学术研讨会论文集 ．261． 1．1．4试验动物 7日龄内昆明系乳鼠(带母鼠)、1．2周龄昆明系小白鼠、2．3周龄昆明系小白鼠、3-4周龄昆明 系小白鼠、5．6周龄18—209SPF级雌性昆明系小白鼠，6周龄雌性昆明系小白鼠，均购自南方医科 大学实验动物中心，饲养于华南农业大学实验动物中心。 1．1．5荧光抗体和ELISA抗体检测试剂盒 抗狂犬病毒N蛋白荧光抗体，购自卫生部武汉生物制品研究所；ELISA抗体检测试剂盒为美国 SYNBIOTICS辛百克斯公司产品，根据说明书进行操作，在有效期内使用。 1．2方法 1．2．1构建含有双G基因的狂