分子生物学的研究法(下).ppt

6 噬菌体展示技术 噬菌体展示（phage display）技术是一种基因表达产物与亲和选择相结合的技术。以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，再通过亲和富集法筛选表达外源蛋白的噬菌体。其建立基于三个原因：(1)形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时保持有外源蛋白的活性。 (2)利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗(panning)方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体。通过多轮“吸附-洗脱-扩增”过程，即噬菌体与靶分子结合而被保留，未吸附的噬菌体则被洗去，吸附的噬菌体可以从表面再回收，再感染细菌，从而大量富集噬菌体。 (3)外源多肽或蛋白质表达于噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分，可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序被推导出来。 从噬菌体抗体库中筛选特异性抗体 经典方法主要有两种： 1)将纯抗原包被在固相介质上，如酶标板或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体。 2)将抗原与生物素基团相连，再将其固定在包被有链霉抗生物素蛋白的磁珠上对噬菌体进行筛选。 * 第六章 分子生物学研究方法(下) 本章主要内容 基因表达研究技术 蛋白质组学及研究技术 1 基因改造技术 （1）体外改造 1）缺失：DNA→限制酶酶切→外切酶Bal 31酶切 →连接酶。 2）点突变：DNA→变性→与突变的引物杂交→聚合反应，连接反应。 定点突变（site-directed mutagenesis） 是指通过PCR等方法向目的DNA片段中引入点突变，使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失等。定点突变能迅速和高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状，是基因工程和蛋白质工程的重要研究手段。 基因的体外改造 （2）体内改造 基因敲除：是一种基因打靶技术。主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段；也可通过插入突变,使靶基因失活。 1）同源重组 2）非同源重组 ?2.1 凝胶阻滞试验（gel retardation assay） 凝胶阻滞试验，又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay, EMSA ），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。若此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。 2 DNA与蛋白质相互作用研究 凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带 A C B 放射自显影 * * * * 凝胶电泳 放射性标记的DNA 细胞蛋白质提取物 蛋白质与DNA结合 * * * * * * B DNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢 滞后带表明DNA与蛋白质结合 2.2 DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay） 将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链单个末端标记的双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA单链只发生一次磷酸二酯键断裂。 若蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端1个、2个、3个核苷酸等一系列长度仅相差一个核苷酸的连续的DNA片段梯度群体。若有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么，它将保护这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的空白区域，人们形象地称之为“足迹”。 32p 1 5 10 * 1 4 8 10 * 加入蛋