热休克蛋白70与NY-ESO-1多肽复合物的制备以及抗肿瘤效应的体外研究.pdfVIP

热休克蛋白 70 和 NY-ESO-1 多肽复合物的制备以及抗肿瘤效应 的体外研究 中文摘要 【目的】 将原核表达纯化获得的人热休克蛋白 70 （heat shock protein70, HSP70 ）与 肿瘤睾丸抗原 NY-ESO-1 多肽体外连接制备 HSP70-NY-ESO-1 多肽复合物，检测 HSP70-NY-ESO-1 多肽复合物负载的树突状细胞（dendritic cells, DC ）对 NY-ESO-1 阳性肿瘤细胞的体外杀伤效率，探讨增强肿瘤免疫治疗的有效策略。 【方法】 1．人HSP70 的原核表达、鉴定及纯化：RT-PCR 技术获得人 HSP70 全长 cDNA， 将 PCR 产物克隆到原核表达载体 PET-30a 质粒上，酶切与 DNA 测序鉴定后，将 PET-30a-HSP70 重组质粒转化至大肠杆菌 Rosetta(DE3) ，IPTG 诱导蛋白表达，表 达产物行 SDS和 Western-blot 鉴定，His-tag 层析柱纯化 HSP70 蛋白。 2 ．人脐带血树突状细胞的培养及鉴定：联合应用重组人粒细胞/ 巨噬细胞集落刺 激因子(recombination human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和重组人白细胞介素 4(recombination human interleukin-4, rhIL-4)培养 人脐带血单个核细胞来源的 DC ，肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 诱导其成熟。通过倒置显微镜、光学显微镜及透射电镜观察 DC 形态，流式细胞 术鉴定 DC 表型，混合淋巴细胞反应鉴定 DC 功能。 3 ．HSP70-NY-ESO-1 多肽复合物负载 DC 的体外杀伤实验：HSP70 与 NY-ESO-1 多肽体外连接，获得 HSP70-NY-ESO-1 多肽复合物。分别用 HSP70-NY-ESO-1 多肽复合物负载的 DC 、NY-ESO-1 多肽负载的 DC 、HSP70 负载的 DC 以及未经 负载的 DC 刺激淋巴细胞，并以未经 DC 刺激的淋巴细胞作为对照组，共 5 组淋 巴细胞，乳酸脱氢酶(lactic dehydroge-nase, LDH) 释放法检测淋巴细胞对 NY-ESO-1 阳性脑胶质瘤细胞的体外杀伤效率。 【结果】 1．人HSP70 的原核表达、鉴定及纯化：RT-PCR 扩增出大小约 2000bp 的目的片 段，经酶切和 DNA 测序证实，HSP70 基因成功地克隆到原核表达载体 PET-30a 4 质粒上；转入重组质粒的大肠杆菌经 IPTG 诱导后，SDS显示，在分子量 为约 72KD 处有表达量明显增多的蛋白条带，Western-blot 证实其为目的条带， 纯化后蛋白纯度达 95% 。 2 ．人脐带血树突状细胞的培养及鉴定：培养第 8d 的成熟DC(mature DC, mDC) 形态学观察：细胞体积大，形态不规则，有典型的树枝状突起；流式细胞术鉴定： mDC 表达 HLA-DR （80.65% ）、CD86 （76.59% ）、CD83 （74.81% ），较不成熟 DC(immature DC, imDC) 表达明显上升（HLA-DR 、CD86 与 CD83 分别为 25.20% 、17.58%、1.50%）；混合淋巴细胞反应证实：mDC 体外激发混合淋巴细 胞反应能力较强，imDC 则较弱。 3 ．HSP70-NY-ESO-1 多肽复合物负载 DC 的体外杀伤实验：HSP70-NY-ESO-1 多 肽复合物负载 DC 组的淋巴细胞对NY-ESO-1 阳性脑胶质瘤细胞的杀伤活性明显 高于其他四组，差别有显著性意义（P0.001 ）；NY-ESO-1 多肽负载的 DC 组淋 巴细胞杀伤活性高于HSP70 负载的 DC 组、未经负载的 DC 组以及对照组，差别 有显著性意义（P0.001 ）；HSP70 负载的 DC 组、未经负载的 DC 组与对照组相 比杀伤率无显著差别（P0.