甜菜夜蛾几丁质合成酶的表达及初步纯化.pdfVIP

甜菜夜蛾几丁质合成酶的表达及初步纯化 专 业：农业昆虫与害虫防治 硕士生：裘雪梅 指导老师：张文庆教授 摘要 几丁质是昆虫表皮(外骨骼)的主要成分，也是许多昆虫肠道表皮的重要成 分，构成昆虫围食膜，几丁质大约占昆虫虫蜕干物质的40％，这个数字也因昆 虫种类甚至同一个个体不同种类的表皮而异。几丁质在昆虫中起到肌肉着生点、 保护内脏器官和防止水分蒸发的作用，并且可以防止有害物质的入侵。各种几]。 质的合成是由几丁质合成酶(UDP—N一乙酰一D一氨基葡萄糖：几丁质4一B—N乙酰氨 酰葡镯糖转移酶)作用发生的，这是一种高度保守的酶，存在于任何有几丁质合 成的有杌体中。它利用uDP—N一乙酰氨基葡萄糖作为糖原料合成几丁质聚合体。 本文以目前重要的农业害虫一～甜菜夜蛾(跏矗印耙m蹦f2姗)为研究对象， 根据已克隆的甜菜夜蛾几丁质合成酶全长序列，选择其中保守的催化域片段进行 克隆表达。首先根据已知序列设计一对特异性引物，引物序列如下： Hind¨l酶切位点)．以实验室存有的克隆到PMD一18T载体上的甜菜夜蛾几丁质 合成酶催化域片断(PMD—SeCHS)为模板，进行PCR扩增，将得到的目的大小的 片段进行割胶回收，然后进行BamHl和Hind¨I双酶切，将得到的带有粘性末端 大肠杆菌TGl中，筛选菌，提质粒，酶切鉴定后，将其转入大肠杆菌M15中测 序鉴定。测序正确的菌液保存，并用IPTG诱导使其表达。结果表明甜菜夜蛾几 丁质合成酶片段基因已成功表达。 在体外表达了甜菜夜蛾几丁质合成酶催化域片段的基础上，还根据pQE30 载体本身带有6·His标签，它能将目的蛋白与6个组氨酸进行融合表达，而Ni —NTA(镍一次氨基三乙酸)树脂对含有六个连续的组氨酸残基的亲和标签一六 组氨酸标签(6-Histag)的蛋白的高度选择性，将目的蛋白进行纯化，结果目的 蛋白的纯度增加了，可还是有少量的非目的带的出现。但是足以证明了所表达的 目的蛋白含有6-His标签，而且可以用来进行酶的活性等的研究。本论文的意义 在于将几丁质合成酶的保守片段进行体外表达，并将所获得的蛋白质进行纯化， 为筛选新型昆虫生长调节剂奠定基础。 关键词：甜菜夜蛾几丁质合成酶表达纯化 and Of preIimlnarypurification ExpresSion chitin !沪odpp玉e，冒ex匆c，a’ssynthase M and control ajor：AgrIcu|furaIInsectspests Name：OIUXue．mei SuperVisOr：ZHANGWen—qing ABS’rRACT is ofthemain of Chilinone insect compositionepidermis(oulerbone)， andwhichis the alsO OflheintestinaI of impOrtantcOmpOsitiOn epidermis insect．ChitinisaIsoan ofinsect NMR integraIpart per．trophicmatrices，S0fids and reVealedthatthechitin