电泳技术漂亮的演示稿李敏等.pptVIP

一、前 言 1809年，俄国物理学家Pehce首先发现了电泳现象 ； 1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，并于1948年荣获诺贝尔奖； 70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度 2、简化操作，缩短电泳时间 3、扩大应用范围； 今天，各类电泳技术已广泛应用于生命科学的各个领域。 二、电泳技术的基本原理 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中的泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。从而实现其分离、分析和鉴定。 三、迁移率的概念及其影响因素 设一带电粒子在电场中所受的力为F，则 F = QE （Q为粒子所带电荷，E为电场强度） 根据Stoke定律，一球形分子在溶液中运动所受的阻力F’为： F’= 6πrηv （v为分子移动速度；r为分子半径；η为介质黏度） 当分子达到动态平衡时，F = F’ 即 QE= 6πrηv 移项得 v/E=Q/ 6πrη v/E表示单位电场强度时粒子运动速度，定义为迁移率， 也称电泳速度，以?表示。 因此上式也可表示为： ?=Q / 6πrη 四、电泳的分类 五、应 用 举 例 2.琼脂糖凝胶电泳（Agar Gel Electrophoresis，AGE） 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 琼脂糖 半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷 琼脂糖凝胶的特点 优 点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性。 缺 点 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 应 用 1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化 2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标 ? 305 例尿蛋白普通A GE 按其图谱特征可分为五种类型, 第一类：尿蛋白总量较少(各区带均浅) , 白蛋白(ALB)区带较低( 30% )、 ALB 外各区带包括A 1、 A 2、 B 1 和C区带齐全(如2～ 5 号) , 少数病例在ALB 外仅显示1～ 3 条浅区带(如1 号)。 第二类：仅单一ALB 区带, 或ALB 占绝大部分(75%以上) , 有极少量的A 1、 稍多的B 1 和C区带, 无A 2 区带(如6～ 10 号)。 第三类：ALB、A 1、 A 2、 B 1 和C区带齐全, 且后三个区带中某个或多个区带不均一,ALB 约占65%以下(如11～ 16 和18号) ; 其中某些病例A 2 区带和B 1 区带显著增高, 两者均可达10%～ 15%以上, C区带可较低或较高,ALB可降至50%左右或以下(如15 号)。 第四类：除ALB 仍很高(约65%～ 75%)外, 五个区带可能均有, 但后三个区带中无明显不均一现象(如17 号) , 此类图谱不太典型, 与第三类比较接近。 第五类：图谱特征明显,在B到C区带有显著增高的孤立窄区带, 另外可有较低的ALB 区带(如19 号)。 始于20 世纪60 年代 具有电泳和分子筛的双重作用。 此法重复性高,凝胶柱弹性好,无电渗作用,且设备简单,样品量少,分辨率高,广泛用于分离蛋白质及较小分子的核酸,且能测定蛋白质、酶和核酸的分子量。 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子（氯离子）， 慢离子（甘氨酸负离子） B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。 浓缩胶的作用？ 现在普遍采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），包括非变性电泳(native PAGE)和SDS两种，前者主要是在分离蛋白复合物时经常用到。后者是在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），蛋白质分子被大量SDS阴离子包裹，消除了它们间原来携带的电荷差别，因而其迁移率仅反映蛋白质分子大小，故广泛用于蛋