PCR技术及其应用45414.pptVIP

荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission SYBR-Green I Taqman探针3′端Q荧光分子能够吸收5′端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5′端荧光分子发出的荧光,只能检测到3′端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板) 时,探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5′外切酶活性,将探针5′端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET ,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量 荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer , FRET) Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Excitation Emission Transfer 荧光共振能量传递（FRET Probe） R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation 双标记探针（Taqman Probe） R Q Excitation R Q Q R Excitation Emission 分子信标（Molecular Beacon Probe） 引物特异性探针（Amplisenor Probe） 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ R Q 5’ R Q R Q 3’ 5’ Q R R R Emission Excitation Q R 引物特异性探针（Amplifluor Probe） 荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便,无需跑胶 全新4通道实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪 PCR技术的应用 1) 基因克隆 重组DNA 质粒DNA 基因片段 大肠杆菌 胰岛素 重组体 + 胰岛素基因 基因工程产品 5’ 5’ Bam H I Bam H I Bam H I Bam H I GTCC GGAC CCTG CAGG GTCC GGAC CCTG CAGG CCTG GGAC GTCC CAGG 质粒DNA 目的基因 限制性核酸内切酶 2)基因检测 A’ 内源性病变基因 正常人 A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等 地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡 A 正常人 病 人 正常 病人 ASO探针法 A C T G ASO探针 正常 病人 PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交 探针杂交 NC膜 探针 正常人 突变纯合子 突变杂合子 PCR-RFLP法： 限制性内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） Ras基因 突变 限制性内切酶 正常 突变 电泳 HLA系统基因分型 PCR-RFLP法 PCR-SSO法 PCR-SSCP PCR-SSP 3)基因配型 PCR-SSP 1 2 3 4 5 6 7 8 PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 引物特异性 （序列特异性引物-PCR技术 ） 4）基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 法医学分析 个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序 PCR-VNTR多态性检测 PCR；电泳检测 （VNTR：数目可变的串联重复序列 ） 父’ 父