Ubiquitin基因介导下PRRSV GP5基因免疫特性研究.pdfVIP

Ubiquitin 基因介导下的PRRSV GP5 基因 免疫特性研究1 蒋文明，汤玉瑜，李玉峰，姜平 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京 (210095) E-mail ：civcul@163.com 摘 要：泛素-蛋白酶体途径是一种高效蛋白降解途径，主要负责真核细胞内蛋白选择性降 解。GP5囊膜糖蛋白是PRRSV的主要结构蛋白，为了评价泛素基因对GP5基因免疫的影响， 本研究将ORF5 DNA片段克隆到载体pCMV-Ub ，构建成重组质粒pCMV-GP5 、 pCMV-Ub-GP5 。两种质粒DNA肌肉注射免疫BALb/ c 小鼠后，分别检测小鼠血清体液免疫反 应和特异性的细胞免疫反应，比较单基因与融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度。结 果表明二者诱生抗体的效率无明显差别，但泛素的融合使得针对GP5的特异性细胞免疫反应 明显增强。 关键词：PRRSV ，GP5 ，Ubiquitin ，细胞免疫应答 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种严重危害养猪业 的传染病[1] 。临床上以妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道 症状和高死亡率为特征。PRRSV属动脉炎病毒科，系单股正链RNA病毒，基因组大小为15kb， 包括8个开放阅读框架,其中ORF5编码病毒的糖基化囊膜蛋白(又称GP5)，是该病毒的主要保 护性抗原，含有中和抗原表位，诱导细胞免疫与体液免疫[2 -4] 。但猪感染PRRSV后产生中和 抗体的时间较晚，而且其滴度较低。泛素(Ubiquitin，简称Ub) 是一个由76个氨基酸残基组 成的非常保守的蛋白质小分子。泛素依赖性的蛋白质降解途径是目前已知的重要的、有高度 选择性的蛋白质降解途径之一。泛素与靶抗原基因的融合表达，可以使泛素化的靶抗原经蛋 白酶体降解后，迅速被加工、处理和递呈，刺激机体MHC- Ⅰ类分子限制的特异性CD+8 T 淋巴细胞增殖、分化，增强DNA疫苗的免疫应答[5 - 7] 。我们假设PRRSV保护性免疫力较低可 能与糖基化蛋白抗原表位空间结构有关，如将Ub基因插入GP5基因的5′端，可有效地将糖基 化蛋白分解成小的多肽，促进抗原表位的递呈，增强免疫效果。本研究为探索Ub融合的 PRRSV GP5基因DNA提高免疫效果的可能，分别构建了pCMV -Ub-GP5 、pCMV-GP5 的真核 表达质粒，并进行小鼠免疫试验。 1 材料与方法 1.1 细胞和质粒 MARC-145 由本实验室保存。pCMV-Ub 质粒由美国Scripps 研究所Whitton 教授惠赠。 pcDNA3-ORF5 质粒由本实验室保存。 1.2 主要试剂 限制性内切酶BglII、MluI、HindIII 、NotI、T4 连接酶、CIAP 购自TaKaRa 公司。DNA 回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。酶标二抗（HRP-羊抗小鼠 IgG ）购自博士德 生物工程有限公司。 1.3 表达质粒的构建 1 本课题得到 教育部博士点基金项目（2003030712 ）、新世纪优秀人才支持计划（NCET-04-0502 ）和国家自 然科学基金30270990 ）的资助。 -1- 1.3.1 目的基因的扩增 根据PRRSV S1 株序列（GenBank AF090173 ），设计两对特异性引物，并在引物5端分 别引入BglII、NotI 限制性内切酶酶切位点。pCMV-Ub-GP5 克隆引物：Ub-GP5.1 5-GCT AGA TCT ATG TTG GAG AAA TGC TTG AC-3 ；Ub-GP5.2 5-GTT AGA TCT TAA GGA CGA CCC CAT TGT TC-3 。pCMV-GP5 克隆引物：CMV-GP5.1 5-AAT GCG GCC GCC ATG TTG GAG AAA TGC TTG AC-3