腺病毒介导的CTLA4Ig基因对共同导入的其他外源性基因在脊髓表达的影响.pdfVIP

中文摘要 腺病毒介导的CTLA4Ig基因对共同导入的其他外源 性基因在脊髓表达的影响 摘 要 载体将各种神经营养因子基因转入脊髓以保护受损的神经元 和促进周围神经再生的研究，已成为神经修复研究领域的前沿 课题。基因治疗的效果依赖于将目的基因特异、高效和安全的 转染受损神经元及神经并高效表达，但由于宿主对病毒载体的 免疫反应，使导入的基因不能在体内长时间高水平表达，从而 限制了导入基因的治疗作用的发挥。本实验将将携带LaeZ基 T 毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋(Cytotoxic associated antigen 达水平变化：并通过对脊髓淋巴细胞亚群分类染色的观察、血 清抗病毒抗体和中和抗体滴度检测，以探讨CTLA4Ig对 AdLacZ表达的影响及其诱导机体的免疫耐受的作用和机理。 2509。将大鼠随机分成两组，每组80只。对照组(A组)导 醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约2cm后正中切口， 去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST．III 中文摘要 型手动推进器，于脊髓后正中动脉旁开O．8mm处注射AdlacZ 针尖向头侧呈45度斜行进针，斜行刺入深度为2．5mm。注射 速度为1m／min，注射完毕后滞针5min，缓慢拔针。充分止 血、冲洗伤口，局部喷洒抗生素预防感染，关闭伤口。两组 在转染病毒后12个不同的时间点鼠尾静脉取血2ml：在转染 后10个不同时间点，对两组动物脊髓进行厚50I_tm的连续冰 冻横切片，计数A组与B组中5．溴一4一氯．3．吲一口杂．13．D．半 表达的高峰期和持续时间；检测血清抗病毒中和抗体滴度； 通过脊髓切片淋巴细胞亚群分类染色，观察CD68、CD4和 CD8淋巴细胞的浸润情况。统计学方法：应用SPSSl2．0软件， 所得数据用均数±标准差表示，组间行成组比较t检验。P值 0．05有统计学意义。 结果 在转染后第～天即可观察到13．gal的表达，蓝染仅限于细胞 核。转染后第2天胞体和突起逐渐被蓝染，转染的细胞数逐 渐增多。转染的高峰期为2~8天，持续时间为2周。B组在 高峰期为2~8天，B组的X-gal染色阳性表达时间约为4周。 围的胶质细胞。转基因表达范围局限于注射点上下各O．6cm 区段，有转基因表达的阳性冰冻横切片数一240片。转基因 中文摘要 神经元在注射同侧表达较对侧强烈。脊髓阳性切片计数显示 两组B-gal在脊髓表达的高峰期均在2～8天，统计学分析表 明两组之间在高峰期间阳性切片数无显著差异(PO．05)。 2共同转染的AdCTLA在脊髓对细胞免疫的影响： 淋巴细胞亚群分类染色观察：A组在病毒导入后24小时内 即出现CD68浸润，2天后开始出现CD8淋巴细胞浸润，3 天时开始出现极少量CD4淋巴细胞浸润。病毒导入后6天 CD68逐渐消退，免疫反应则以CD8淋巴细胞浸润为主，伴 有极少量CDl4细胞浸润。在转染后第8天CD8细胞逐渐增 多，2周时达高峰，其浸润程度较B组严重；持续到第6周 时仍有少量浸润。B组病毒转染后l～6天，脊髓内CD68、 CD8和CD4细胞的浸润程度与A组相似。在转染后第8天 细胞基本消退。两组CD4细胞8天后均稍有增加但浸润的数 量都很少，并且与CD8消退的时间基本一致。 3共同转染的AdCTLA在脊髓对细胞免疫的影响： 抗病毒中和抗体滴度测定：A组转染病毒后第3天血清中可 检测到抗病毒中和抗体，逐渐增加至第3周达到高峰并一直 稳定在这一水平直至第6周。B组在转染后第3天，抗病毒 中和抗体同样也被检测出，逐渐增加至第4周达到高峰并一 直稳定在这一水平直至第6周。与A组相比B组抗体滴度水 平稍低，但在统计学上两组无显著差异(Po．05)。 抑制局部T淋巴细胞的浸润，从而减轻由AdV介导的局部 炎症反应，抑制机体对病毒载体的排斥反应，显著延长共同 中文摘要 导入其它外源基因在脊髓的表达，但不影响基因表达强度。 AdCTLA4Ig对体液免疫应答的抑制作用不明显。 关键词：腺病毒；CTLA4Ig基因；脊髓；淋巴细胞亚群 分类；抗病毒中和抗体