G418和潮霉素B双重抗性小鼠胚胎干细胞饲养层的制备.pdfVIP

细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2005, 27: 206-210 G418和潮霉素B双重抗性小鼠胚胎干细胞 饲养层的制备 * 张梅英　李　华　董婉维　秦　英　杨　葳　王禄增　王太一 （中国医科大学实验动物部，沈阳 1 10 00 1 ） 摘要　　通过脂质体转染的方法，先后将含有neo基因的质粒pWL/neo和含有潮霉素基因的 质粒导入NIH3T3细胞中，利用G418和潮霉素B的药物选择特性，对转染细胞进行压力筛选，经 500g/ml的G418和300g/ml潮霉素B压力筛选后，获得了具有G418和潮霉素B双重抗性细胞 克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异，用PCR法特异性核苷 酸引物检测抗性细胞基因组DNA，可以扩增出对应的核苷酸片段。生长在双抗NIH3T3细胞饲养 层上ES细胞基本保持正常ES细胞特征，成功地培育了G418和潮霉素双重抗性的NIH3T3细胞， 为进行pTet-on和pTRE-H-Insulin目的基因电转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。 关键词　　NIH3T3细胞；转染； G418；潮霉素B； ES细胞 胚胎干细胞(ES cell)是具有多方向分化潜能的胚 1.1.1菌种和质粒 感受态大肠杆菌DH5来自 胎细胞，在理论上可以诱导分化为机体中所有种类 长春军需大学病毒所并由本室保存，pWL/neo和 的细胞，在体外分化抑制培养条件下，具有保持未 pHyg质粒为美国哈佛大学医学院金壮教授惠赠。 [1] 分化状态及无限增殖的能力。自从Evans等 、 1.1.2工具酶和试剂 、白血病抑制因子G418 [2] 6 Martin分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立 [leukemia inhibition factor，LIF(ESGRO 10u/ml)]、 细胞系，ES细胞以其可在体外进行遗传修饰这一特 DMEM为Gibco 公司产品， BRL 丝裂霉素C 点，为转基因动物的制备提供了又一有效的途径， (mitomycin C)、潮霉素B(hygromycin B)为Roche公 并且这一方法克服了转基因鼠突变体系的随机插入 司产品，Lipofectin试剂为Invitrogen公司产品 。新 突变法的盲目性，使转移的外源目的基因在四维时 生牛血清为郑州佰安生物工程有限公司产品，-巯 [3] 空受到有效的调控 ，从而获得更为精细的转基因 基乙醇为Sigma公司产品，胎牛血清为Hyclone公 动物。但是ES细胞必须在饲养层细胞的条件下才 司产品，Taq酶等购自宝生物(大连)有限公司。引 能够进行良好的增殖和传代，因此，在ES细胞培 物序列均由大连宝生物工程有限公司合成。 育转染过程中，首要的步骤是建立适当的抗选择药 1.1.3细胞 细胞由中国医科大学细胞NIH3T3 物的饲养层细胞。在制备饲养层细胞中，除了应用 生物教研室惠赠，ES-D株细胞由中科院生化细胞 3 原代鼠成纤维母细胞外，普遍应用NIH3T3细胞， 研究所丛笑倩教授惠赠。 NIH3T3细胞是一种能在体外长期培养的成纤维细胞 1.2方法 系，在ES细胞体外培养中可用做饲养层。本研究 1.2.1 细胞NIH3T3neo基因的转染 选用正常的 将含有neo基因的pWL/neo质粒和潮霉素基因的 NIH3T3细胞进行转染实验。将25 ml细胞培养瓶培 pHyg质粒先后转染NIH3T3细胞，以获得具有G418养的NIH3T3细胞长满, 用0.25%胰蛋白酶(含0.02% 和潮霉素B双重抗性的稳定克隆细胞系，使其做为 EDTA)将细