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中国农业科学 2009,42(9):3123-3130 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.09.013 柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体基因的构建 及表达产物的生物学活性分析 1 1 2 1 1 1 王中康 ，李泮志 ，袁 青 ，于 红 ，李 蒙 ，殷幼平  1 2 （重庆大学生物工程学院/重庆大学基因工程研究中心/重庆市基因功能与调控重点实验室，重庆 400030 ； 四川省泸州医学院免疫学教研室， 四川泸州 646000 ） 摘要：【目的】构建鼠源抗柑橘溃疡病菌二硫键稳定 Fv 抗体(dsFv）片段基因，原核表达并将其复性为具有 免疫活性的dsFv抗体。【方法】采用PCR定点突变的方法构建dsFv重链（VH）及轻链可变区（VL）基因，分别将 其连接入表达载体中，于 E.coli BL21 （DE3）中诱导表达，表达产物溶解后稀释入复性缓冲液中使其重折叠为dsFv 抗体并纯化。SDS及 Western-blot 分析表达及复性产物，BIAcore 检测 dsFv 与 Xac-LPS 的亲和力，ELISA 验证dsFv的特异性及稳定性。【结果】测序结果表明在VH 的44位和VL 的100位成功引入了半胱氨酸突变位点， 实现了高效的原核表达，表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS分析显示 VH 和 VL 的大小为 23 kD，并将 其成功复性，复性后大小为 46 kD。BIAcore 分析表明 dsFv 对 Xac-LPS 保持了很高的亲和力，亲和常数（K ）达 D 到 3.40×10-10M。ELISA 证明 dsFv 具有较高的抗原特异性并且热稳定性较 scFv 提高近 20℃。【结论】成功表达并 复性了dsFv抗体，为柑橘溃疡病菌的免疫诊断提供了高效优质的重组抗体。 关键词:柑橘溃疡病菌；二硫键稳定Fv抗体；包涵体；复性；BIAcore分析 Gene Construction, Expression and Biological Activity Analyses of Disulfide Stabilized Fv Fragment Against Xac 1 1 2 1 1 1 WANG Zhong-kang , LI Pan-zhi , YUAN Qing , YU Hong , LI Meng , YIN You-ping 1 ( Bioengineering College of Chongqing University/Gene Engineering Research Center/Key Laboratory of Gene Function and Regulation of Chongqing, Chongqing 400030 ; 2Department of Immunology, Luzhou Me