粟酒裂殖酵母N-糖酰胺酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析.pdfVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, April 25; 24(4): 592-597 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn © 2008 Institute of Microbiology, CAS CSM, All rights reserved 研究报告 N- 1, 2 1 2 1 信丰学 , 王鹏 , 钟盛华 , 祁庆生 1 , 250100 2 , 330045 : 根据GenBank 中公布的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)N-糖酰胺酶(Png1p)cDNA 序列, 设计并合成 一对特异性引物, 利用RT-PCR 技术从粟酒裂殖酵母中克隆出糖酰胺酶 cDNA 。将得到的基因克隆到表达载体pET-15b 中。重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3) 中, 经诱导表达和纯化提取后, 进行酶活测定。实验结果表明, 该酶的分子量约 为39 kD, 纯化后的重组N-糖酰胺酶可以对变性处理的糖蛋白进行糖链的切除, 且这种作用需要还原剂DTT 的辅助作 用; N-糖酰胺酶只对错误折叠的糖蛋白有作用, 对天然的糖蛋白没有作用。等量粟酒裂殖酵母Png1p 在不同温度、pH 、 DTT 浓度和底物变性温度下对等量核糖核酸酶B(RNase B) 的脱糖基化检测发现, 重组酶的最适反应温度30°C, 最适反 应pH 为7.0, 需要的最适DTT 浓度为 10 mmol/L, 底物在 100°C 处理 10 min 时酶的脱糖基化率最高。 : N-糖酰胺酶, RT-PCR, Ribonuclease B, 酶活测定 Expression, Purification and Characterization of N-glycanase from Schizosaccharomyces pombe in Escherichia coli 1, 2 1 2 1 Fengxue Xin , Peng Wang , Shenghua Zhong , and Qingsheng Qi 1 Science Department, Jiangxi Agriculture University, Nanchang 330045, China 2 Life Science School, Shandong University, Jinan 250100, China Abstract: One pair of primers were designed and synthesized on the base of the cDNA sequence encoding Schizosaccharomyces pombe N-glycanase reported on the GenBank. The cDNA sequence encoding Peptide N-glycanase was cloned from the Schizosaccharomyces pombe by RT-PCR. And then the RT-PCR product