重组抗菌肽基因克隆及其在Pichiapastoris中的表达及鉴定.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（６ｓ）：２７～３１ 重组抗菌肽基因克隆及其在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ 中的表达及鉴定 彭　梅　孙茂盛 （中国医学科学院／北京协和医学院医学生物学研究所　昆明　６５０１１８） 摘要　根据毕赤酵母对遗传密码的偏爱性，在不改动氨基酸序列的前提下，用化学法合成抗菌肽 麻蝇素Ａ的基因片段，合成片段拼接后，与 因子重组，重组基因再构建到表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ上， α 得到受乙醇氧化酶ｌ基因（ＡＯＸ１）的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒，经限制性酶切鉴 定及核苷酸序列分析，阳性重组子转化 ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５宿主菌，经表型筛选，阳性克隆用甲醇诱导 表达．表达产物经ＰＡＧＥ凝胶电泳分析、纯化及抗菌活性检测，结果表明，重组抗菌肽基因在酵母 中获得高效表达，表达产物经 因子信号肽分泌到胞外，具有较强的抗菌活性。 α 关键词　基因克隆　抗苗肽　Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ　表达 中图分类号　Ｑ７８６ 　　抗菌肽（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ）最初是从昆虫免疫 并使肿瘤坏死因子活化，因而有较强的抗肿瘤作用。 后的血淋巴细胞中发现的一类碱性多肽类物质。最早 　　建立有效的基因工程方法来获取抗菌肽是目前主 ［１，２］ 的抗菌肽是 １９８０年瑞典科学家 Ｂｏｍａｎ等 从惜古 要的研究方向。由于抗菌肽对细菌具有很强的杀伤作 （ｈｙａｌｏｐｈｏｒａｃｅｃｒｏｐｉａ）蛹中发现的。到目前为止，在昆虫 用，不宜在原核系统中直接表达，一般采用融合表达或 中已发现了大量的抗菌肽。这些抗菌肽抗菌谱广且效 在酵母中表达．毕赤酵母表达系统是目前最为成功的 率高，其作用机制独特，不易产生抗性．在抗生素的抗 外源蛋白表达系统之一，国外已有小肽在毕赤酵母中 药性日趋严重的情况下，抗菌肽极有可能成为新的抗 ［４］ 成功分泌表达的报道 ，本课题成功地克隆了重组抗 ［３］ 生药物的来源 。 菌肽麻蝇素Ａ基因，并构建了高效分泌表达麻蝇素Ａ 　　当前的研究多集中于其它昆虫的抗菌肽，而来源 的重组毕赤酵母工程菌，初步建立从发酵液上清中分 于麻蝇的抗菌肽则很少，特别国内几乎没有研究麻蝇 离纯化麻蝇素Ａ抗菌肽的工艺流程，并通过体外实验 素Ａ的相关报道。与其它昆虫抗菌肽进行比较，来自 对重组抗菌肽抑制细菌活性进行研究。 麻蝇的一些抗菌肽具有更强的抗菌作用和多重生物作 用，如抗真菌、抗肿瘤等等。人类真菌病害在目前仍是 １　材料与方法 一个难以解决的问题，真正对真菌有强大杀伤力的药 物很少。麻蝇素除了具有广谱高效的抗细菌活性外， １．１　菌株和质粒 同时还对从麻蝇中分离出的一种抗真菌肽 ＡＦＰ 　　ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５，抗菌肽敏感菌株 Ｅ．ｃｏｌｉ （ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＦＰ）有很强的增效作用。日本东 α － ＋ 京大学的名取俊二教授（１９８６）首