苏云金芽胞杆菌cry1Ac与烟草几丁质酶tchiB双价基因克隆表达及其杀虫增效作用研究.pdfVIP

卷 期 ! # 微 生 物 学 报 !（）： # %%$ ’ %%( 年 月 日 $%% $ ! !#$ %’()(*(+$ ,-$ ! )*+*,-*. $%% !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 苏云金芽胞杆菌 ’. !# 与烟草几丁质酶 #/ $ 双价基因 克隆表达及其杀虫增效作用研究 ， $ $ 丁学知 ，罗朝晖 ，夏立秋 ，高必达 ，孙运军 （湖南师范大学生命科学学院微生物分子生物学湖南省重点实验室 长沙 !%%(） $ 湖南农业大学生物安全科学技术学院 长沙 ） （ !%$( 摘 要：将苏云金芽胞杆菌（ ， ） 菌株质粒上的 基因和烟草几丁质酶 基因 !#$%%’ ()*$+,$-+’$’ 7M ! N%( #*. 0+ (#)$7 （去掉信号肽或去信号肽再加肠激酶位点）构建了重组基因。经过双酶切和亚克隆，将带有 #*. 0+ 基因上游启动序 列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体 ，分别构建重组质粒 、 ，在大肠杆菌 OP:/2 OPQ0++7# OPQ0++7 中扩增后，将两个重组质粒分别电转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株 R7Q%% 中，获得重组菌株 P0++7# 和 P0++7 。经液体双相胞晶分离提取离心后，将晶体和上清液分别进行S)ST0UG 分析，双价基因重组与 #*. 0+ 基 因在无晶体突变株中表达量相比较，几丁质酶活性提高2 N$ 倍，双价重组蛋白表达量显著提高，主要产生 /%V)? 蛋 白条带。经定量分析：双价重组目的晶体蛋白占总蛋白量的 ； 蛋白占总蛋白量的 。发酵上清液 #N/(W 8.J0+ !$ W 经#% W 硫酸铵沉淀，显示出一条分子量为(V)? 新蛋白条带。经原子力显微镜和电子显微镜观察，表达后的重组 蛋白呈菱形或椭原形晶体，其规格约为N2 X / N% ,；经生测分析，重组菌株P0++7# 和 P0++7 毒力相近，与P0+ 菌 ! 株比较毒力提高 倍，对棉铃虫（ ）具有高效杀虫活性，其 值分别为 和 ! N2 /-%$#0*1 *2$,0* /F 58 4 N HY,5 N/! HY