亲和色谱用无色合成配基对胰蛋白酶纯化功能的研究.pdfVIP

研究报告 亲和色谱用无色合成配基对胰蛋白酶纯化功能的研究 杨 利 高昆玉* 程侣柏* 邹汉法 改 玉奎 （中科院大连化学物理研究所 国家色谱研究分析中心 大连 116011 * 大（连理工大学 大连 116012） 提要 考察了一种新型的阳离子无色三嗪化合物、几种阴离子无色三嗪化合物和三嗪染料作为亲和色谱配基 对胰蛋白酶的吸附性能。猪胰蛋白酶经阳离子型配基一步纯化 比活达到116U/mg纯化21.6倍 回收率88%。 关键词 亲和色谱，无色三嗪配基，胰蛋白酶 2.2 实验方法 1 前 言 2.2.1 配基的合成及固定化 参照文献 [4-6] 在整个生物技术的研究和开发中，下游产品的 2.2.2 酶和蛋白的检测 胰蛋白酶和糜蛋白酶活 分离与纯化占有十分重要的地位 亲和色谱是分离 性的检测参照文献[7]，蛋白质含量检测用考马斯亮 纯化生物大分子的重要手段，由于其配基对生物大 蓝法[8]，以牛血清白蛋白为标准 分子可逆的特异性结合，纯化效果远优于其它方法， 2.2.3 粗酶液的制备 将猪胰蛋白酶粗品500mg 但所用配基大都是从特定组织中提取出来的价格昂 干（粉）加入到平衡缓冲液中，于4℃下振荡3h，离心 贵的生物小分子，如辅酶、抑制剂、抗体或抗原等 染 (4000r/min)1Omin 上清液在4℃下对平衡缓冲液 料配基亲和色谱是以活性染料为配基的纯化生物大 透析过夜 透析过的酶溶液使用前需离心5min（由 分子的分离技术，它比传统的生物配基亲和色谱具 于材料的限制，考察配基吸附影响因素和柱色谱分 有取材广泛、价格低廉、结合容量大、稳定性好、易与 离时分别采用了牛胰蛋白酶和猪胰蛋白酶） 载体偶联、适用范围广、通用性好等优点[因此，染 2.2.4 染料及无色配基对胰蛋白酶的初分离 染 料配基已成为亲和色谱纯化生物大分子的重要组成 部分 通过研究系列蒽醌染料与蛋白质相互作用的 料或无色配基吸附介质0（.5g湿凝胶）悬浮于装有 机制发现，染料分子中的蒽醌环并非必要的功能基 2mLO.lmol 醋酸盐缓冲溶液[含46U胰蛋白酶， 团，而与三榛环连接的尾基结构氨（基苯磺酸异构体 0.02molLCaCl2和0.05mol/LNaC1,pH4.0（阴离 等）和桥基结构 苯（二氨类异构体）对蛋白的吸附容 子配基）或pH5.5（阳离子配基）]的试管中，室温 量及选择性有显著影响[2为此，我们设计并合成了 下，试管在振荡器中缓慢振荡30min，凝胶自然沉降 六个不带蔑醌环的均三嗪无色配基，实验结果表明， 后，检测上清液中的酶活性及蛋白含量 用平衡缓冲 它们对小牛肠碱性磷酸单酯酶的分离纯化效果比 液洗掉未吸附的酶，然后用lmol/LKC1解吸结合 CibacronBlueF3GA还好3,4]本文在此基础上将合 酶，再测上清液中的酶活性及蛋白含量 成的带有阴、阳离子基团的无色三嗪化合物及染料 2.2.5 染料及无色配基对猪胰蛋 白酶的柱色谱分 作为亲和色谱配基，研究了对胰蛋白酶的纯化 离过程 将经透析的胰蛋白酶粗酶萃取液 5（mL，含 2 材料和方法 114U胰蛋 白酶、312U糜蛋白酶，胰蛋白酶比活为 5.3U/mg）加到用0.lmol/L醋酸盐缓冲液 对（于阴 2.1 材料 离子配基，pH4.0；对于阳离子配基，pH5.5）预平衡 牛胰蛋白酶、SepharoseCL-4B和考马斯亮蓝