以人胚肾培养细胞poly(A)+RNA为模板反转录合成ds=-cDNA的研究.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing) 6 (6);4-6 1984 以人胚肾培养细胞poly(A)+RNA为模板 反转录合成ds=-cDNA 的研究 王嘉玺 周 刊 方继明 马贤凯 军（事医学科学院基础医学研究所，北京） 反转录酶合成 cDNA常产生不完全的转 EDTA (pH6.9）终止反应。 尔后加25川150 录产物。为获得全长的cDNA拷贝并提高它 mMNaOH混匀，于65℃水浴反应1小时降解 在总 cDNA中的比例，已有不少文献提出了一 mRNA模板，再加251AI1MTrlsHC1(pH8.0) 些措施，效果如何尚有争论[a]［。我们以人胚肾 及25川1NHCI中和反应混合物。等体积酚抽 培养细胞poly(A)+RNA为模板，参照Maniatis 提两次，水相经SephadexG100柱层析，收集第 的方法1153，建立了一个比较简单易行的反转录 一峰合并经酒精沉淀冻干备用。同时设不经酚 程序，合成了较长的cDNA拷贝。 抽和 SephadexG100柱层析组进行比较。 第二条链的合成 在一只Eppendorf管 材 料 和 方 法 内冻干 1.8nmol的 3［Hl-dTTP，加 56闰2X 试荆和酶 dATP,dCTP,dGTP,dTTP, 第二链缓冲液 0（.2MHEPESpH6.9,20mM 均为Sigm二产品。[3H]-dTTP(27.2Ci/mmol, MgCl,,5mMDTT,0.14MKCl，各lmM 的 0.5ma/ml）上海原子核研究所产品。Oligo dATP,dCTP,dGTP,dTTP）仔细溶解。取 (dT)la-ls、反转录酶(AMV-RTase,20U/1,1)[], lugj 冻干的第一条链 s（s-cDNA）溶于56川双 为BRL产品。大肠杆菌DNA聚合酶I(500U 蒸水，并转移至上述Eppendorf管内，加适量 /0.11ml)为Boehringer产品。 Si酶为 Sigma DNA聚合酶I,370C水浴中反应1小时或15CO 产品。其余试剂为分析纯。 水浴中反应2-5小时。加4脚0.5MEDTA 模板 mRNA 经 Oligo(dT）一纤维素在 (pH6.9）终止反应。等体积氯仿一异戊醇 (24: 亲和层析纯化的人胚肾细胞poly(A）十RNAII3a 1,v/v）抽提2次8〔!。水相经SephadexG100柱 第一东链的合成 在冰浴内向一只Ep- 层析去除未掺人之核昔酸。合并第一峰收集 pendorf试管加1.8nmol最（终浓度360M)[;H]- 液，调至NaCl300mM、NaAc(pH4.5)30mM, dTTP,60g人胚肾细胞poly(A)+RNA,501各 ZnCl,3mM，加Si酶适量，37℃水浴中反应 1 为 lOmm的dATP,dCTP,dGTP,dTTP的混 小时。尔后调S6S至。.1务，氯仿一异戊醇抽 合物 （以 10mMTrisHClpH7.5的缓冲液配 提，酒精沉淀冻干，保存于一20℃备用。 成），冷冻干燥。再向冻干物内顺序加人： 250 ds-cDNA分T-JUN定“， 取20,000cpm mMKCl,5倍浓缩的反转录酶缓冲液 5（00mM 经SI酶处理的 ds-cDNA在 1.4并碱性琼脂糖 TrisHCl，pH8.3；50mMMgC1a,50mMDTT)， 凝胶上电泳，分子量标准物： ,DNAEcoRI酶 Oligo(dT)1a-18(100g/ml)，放线菌素D(2500g/ 切片段和 h(X174(RF)DNAHaeIII酶切片段 rnl)，反转录酶 (20U/01）各 10川。反应总体积 Wang五axietal.:EnzymaticSynthesisofds-cDNA 5001，于42℃水浴中反应1小时，加21AI0.5M byReverseTranscriptase 斗 也同时进行电泳。电泳电压100V,4-5小